Иммуноэлектрофорез

Принцип метода заключается в соединении техники электро­фореза с реакцией иммунодиффузии в агаре. Метод эффективен при исследовании многокомпонентных антигенов или антител.

Метод качественный, при автоматизации - полуколичествен­ный.

Реакция проводится в два этапа: вначале проводят электро-форетическое разделение смеси белков. По окончании электро­фореза в канавку вносят антисыворотку. Антиген и антисыворот­ка диффундируют навстречу друг другу, образуя дугообразные линии преципитации. Количество, форма, положение этих линий характеризуют антигенный состав исходного биоматериала (в данном случае сыворотки).

Характер иммунодефицитных состояний определяется также при сравнительном изучении фореграмм сыворотки и мочи.

Существует множество модификаций иммуноэлектрофореза в зависимости от задач диагностики (перекрёстный, «ракетный», радиоиммунный и др.).

Иммунодиффузия продолжается не менее 24 ч при указанной в методике силе тока. После иммунодиффузии пластины высу­шивают, окрашивают и интерпретируют результаты.

Чувствительность метода - более 100 мкг/мл.

Специфичность метода зависит от чистоты антисыворотки (поликлональная, моноклональная). Качество исследования по­вышается при использовании полностью автоматизированных систем.

Иммуноэлектрофорез широко распространен в лабораторной практике для исследования белков сыворотки, СМЖ, мочи, экс­трактов из органов. Наибольшее значение имеет при диагностике парапротеинемий и иммунодефицитных состояний. Метод широ­ко используется для характеристики чистоты препаратов в фар­мацевтической промышленности, производстве вакцин и др.

Иммуноэлектрофорез позволяет разделять сложные смеси антигенов, например антигены, содержащиеся в сыворотке крови.

1. Разделение осуществляют в агаровом геле, помещенном в электрическое поле, причем рН геля устанавливают так, что­бы положительно заряженные белки перемещались к катоду, а отрицательно заряженные - к аноду.

2. Между лунками вырезают канавку, которую заполняют рас­твором антител, диффундирующих в гель.

3.Антигены и антитела формируют дуги преципитации.

Встречный электрофорез проводят в агаровом геле, рН ко­торого устанавливают так, чтобы антитела (Ат) несли суммарный отрицательный заряд, а исследуемый антиген (Аг) - положитель­ный. В электрическом поле антиген и антитела движутся на­встречу друг другу и преципитируют. Принцип метода тот же са­мый, что и при двойной иммунодиффузии, однако чувствитель­ность выше в 10-20 раз.

Ракетный электрофорез позволяет количественно опреде­лять антиген в антителосодержащем геле, рН которого подбирают с расчетом, чтобы движения антител не происходило, а антиген нес суммарный отрицательный заряд. Линия преципитации очерчивает область в виде ракеты, длина которой пропорциональна концентрации антигена. Определить эту концентрацию можно по калибровочной кривой. Оба метода основаны на различаи суммарных зарядов антигена и антител при выбранном pH.

Метод иммуноферментного анализа с использованием индикаторных полосок

Используется система ферментных каналов, которая преду­сматривает включение двух ферментов. Продукты одной фермен­тативной реакции служат субстратом для второго фермента. По­верхность индикаторной полоски покрывают антителами против микробного антигена. Вместе с антителами на твёрдой фазе им­мобилизованы молекулы фермента глюкозооксидазы. Полоску погружают в исследуемый образец биоматериала (сыворотка, слюна, моча). Антитела связываются с присутствующим в образ­це антигеном, далее индикаторную полоску переносят в раствор с коньюгатом стандартного антигена с пероксидазой, субстрат для глюкозооксидазы (глюкозу и хромоген (4-хлорнафол).

Глюкозооксидаза катализирует превращение глюкозы в глю-коновую кислоту, в результате чего образуется перекись водоро­да. Происходит связывание коньюгата свободными антителами на полоске. За счёт воздействия пероксидазы происходит фер­ментативное расщепление перекиси водорода, образующийся атомарный кислород окисляет хромоген. На полоске регистри­руют образование голубого нерастворимого соединения. Интен­сивность окрашивания зоны внутреннего стандарта сравнивается с окраской основной части индикаторной полоски.

Иммуноферментный метод сменил иммунорадиометриче-ский и имеет ряд преимуществ:

1. Отсутствие контакта с радиоактивными веществами.

2.Меньшие затраты на оборудование (высокая стоимость счет­чиков)

3.Устойчивость меченых соединений при хранении (не менее 6 мес.)

4.возможность автоматизации процесса.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ

Постановка реакции нейтрализации на лабораторных животных

Пробирки расставляют в штативы параллельными рядами так, чтобы количество пробирок в каждом ряду соответствовало числу используемых в опыте разведении вируса (последнее должно превышать биологический титр вируса), а количество ря­дов — числу взятых сывороток и контролен. Для контроля в один ряд пробирок наливают нормальную сыворотку, в другой — изо­тонический раствор хлорида натрия (контроль активности виру­са). Ингредиенты вносят в пробирки в объеме 0,5 мл. Сыворотки используют неразведёнными или в разведении 1:5. Готовят раз­ведения вирусной суспензии, которые вносят в пробирки, содер­жащие в равном объеме специфические сыворотки, нормальную сыворотку или изотонический раствор хлорида натрия. Смеси встряхивают, выдерживают в течение 1—2 часа при температуре термостата, комнатной температуре или 18—20 ч при 4°С и вво­дят для индикации инфекционного вируса лабораторным живот­ным. Каждой смесью в равном объеме заражают по 4—6 лабора­торных животных.

Критерием наличия инфекционного вируса в смеси служит гибель лабораторных животных. При оценке результатов высчи­тывают по методу Рида-Менча предельное разведение вирусной суспензии, которое вызвало гибель 50% зараженных животных. Для каждой взятой в опыт иммунной сыворотки высчитывают индекс нейтрализации, т. е. максимальное количество ле­тальных доз вируса, нейтрализованное данной иммунной сы­вороткой по сравнению с контрольной сывороткой. Тип ви­руса устанавливают по типоспецифической сыворотке, которая показала наивысший индекс нейтрализации.

Постановка реакции нейтрализации в развивающихся куриных эмбрионах

Критерием наличия инфекционного вируса в смеси его с сы­вороткой при использовании в качестве индикаторной системы куриных эмбрионов является выявление морфологических изме­нений на хорион-аллантоисных оболочках или гемагглютинина в аллантоисной жидкости эмбрионов. При оценке результатов по методу Рида-Менча для куриных эмбрионов определяют — одну ИД₅о.

Реакция нейтрализации по методу цветной пробы.

Цветная проба основана на способности вирусов изменять метаболическую активность зараженных клеток, что определяют по цвету индикатора, содержащегося в среде. В незараженных культурах клеток под влиянием выделяющихся продуктов кле­точного метаболизма рН среды сдвигается в кислую сторону, вы­зывая изменение цвета фенолового красного. В зараженных куль­турах в результате дегенерации клеток их метаболическая актив­ность подавляется, и цвет фенолового красного не изменяется или изменяется частично. Специфические иммунные сыворотки, нейтрализуя вирус, предотвращают угнетение метаболизма кле­ток.

Сущность реакции вирусной нейтрализации в культуре кле­ток.

Специфические антитела прочно соединяются с вирусной частицей, в результате взаимодействия между вирусом и антите­лом происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вирусной частицы с чувствительными клетками. В результате указанного взаимодействия вирус утрачивает способ­ность размножаться в чувствительной к нему биосистеме. В качестве чувствительной биосистемы могут выступать культура клеток, куриный эмбрион, организм чувствительного лабораторного животного.

В реакции нейтрализации участвуют 3 компонента:

1. Вирус;

2. Сыворотка, содержащая антитела;

3. Биологический объект

Перед постановкой реакции готовят вируссодержащую сус­пензию из выделенного возбудителя или из известного лабора­торного штамма {при проведении титрования сывороток). В зави­симости от вида вируса его выращивают в культуре ткани, в ор­ганах лабораторных животных, в курином эмбрионе. Для реакции нейтрализации пользуются культуральные жидкости, суспензии органов лабораторных животных, аллантоисную и амниотиче-скую жидкости куриных эмбрионов.

В зависимости от целей исследования реакция вирусной ней­трализации может ставиться в 2 направлениях:

1. для идентификации вируса.

1. для проведения серологической диагностики вирусных ин­фекционных заболеваний.

Перед постановкой каждого нейтрализационного опыта ви­рус предварительно титруют, определяя его конечное разведение, вызывающее повреждение культуры ткани или инфицирование лабораторных животных, куриных эмбрионов.

Методика подготовки реакции.

Клетки выращивают обычным способом в матрацах до обра­зования сплошного монослоя. Затем их снимают со стекла версе-ном, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин 5—10 мин, ресуспендируют в питательной среде, контролируют на стериль­ность

Титрование вирусов в цветной реакции. Готовят 10-кратные разведения вирусной суспензии на питательной среде, содержа­щей 2% бычьей сыворотки. Каждое разведение вируса вносят в объеме 0,25 мл в 2 пробирки. К ним добавляют по одной дозе клеток в объеме 0,25 мл, 0,25 мл питательной среды и 0,6—0,8 мл вазелинового масла.

В пробирках, содержащих вирус, клетки дегенерируют и цвет среды не изменяется или меняется лишь частично: остается красным или оранжевым. Желтый цвет среды в пробирках свидетель­ствует об отсутствии вируса и наличии живых клеток.

Результаты реакции оценивают по методу Рида — Менча, ус­танавливая то наибольшее разведение вирусной суспензии, кото­рое подавило метаболизм в 50% зараженных пробирок (среда со­хранила красный или оранжевый цвет), и принимая его за одну ЦПД₅о.

Реакция нейтрализации для идентификации вируса

Различные разведения вируссодержащего материала смеши­вают с неразведённой противовирусной сывороткой. Смесь ком­понентов инкубируют в термостате при температуре 37 ⁰С в те­чение 1-2 часов или при температуре 4°С в течение 18 часов. Смесью вируса и сыворотки заражают культуру клеток. При ре­гистрации реакции определяют нейтрализующий эффект антител сыворотки по отсутствию цитопатического действия вируса на клетки. Тип выделенного вируса соответствует типу иммунной сыворотки, предупредившей развитие специфической дегенера­ции клеток.

Титрование антител в цветной реакции.

При проведении серологической диагностики вирусных ин­фекций с помощью реакции нейтрализации определяют динами­ку нарастания титра вируснейтрализующих антител по извест­ному вирусу. Для этого пользуются парными сыворотками, взя­тыми от больного в разные сроки - в начале и в конце заболева­ния, диагностическое значение имеет 4 кратное и более возраста­ние титра антител, регистрируемое в ходе заболевания.

Готовят двукратно возрастающие разведения используемой сыворотки, каждое из которых в объеме 0,25 мл вносят в про­бирки параллельных рядов, количество которых соответствует числу взятых в опыт серологических типов вирусов. Во все про­бирки добавляют по 0,25 мл вирусной суспензии, содержащей 100 ЦПД₅о. Смеси инкубируют 1 ч при комнатной температуре, добавляют по 0,25 мл суспензии клеток, термостатируют при 37°С. Опыт сопровождают тремя контролями: 1) контроль кле­ток; 2) контроль токсичности используемой сыворотки; 3) кон­троль дозы вируса

Пробирки инкубируют в термостате в течение 6—7 дней и оценивают результаты, ориентируясь на состояние контролен клеточных суспензий.

В пробирках, содержащих полиостью нейтрализованный ан­тителами вирус, метаболизм клеток не нарушается и цвет среды становится желтым. При частичной нейтрализации вируса анти­телами часть клеток остается живой, и среда приобретает оран­жевый цвет. При отсутствии антител вирус вызывает дегенера­цию клеток, метаболическая активность их подавляется и среда остается красной.

За титр антител принимают то предельное разведение сыво­ротки, которое нейтрализует действие 100 ЦПД₅₀ вируса и пре­дотвращает угнетение метаболической активности клеток (жел­тый цвет среды).