Адсорбированные сыворотки.

Специфические сыворотки, которые содержат в своем соста­ве только видовые или типовые антитела и соответствуют опре­деленному виду или типу микроба называются адсорбирован­ными и монорецсп горными.

Адсорбированные сыворотки могут быть монорецепторными, т. е. содержать только один вид агглютининов, или поли­валентными - содержать два рецептора или больше. Адсорби­рованные сыворотки готовят для идентификации дизентерийных бактерий, сальмонелл, холерных вибрионов, бруцелл. Для произ­водства адсорбированных и монорецепторных сывороток подби­рают и селекционируют штаммы микробов, предназначенные специально для иммунизации животных.

Адсорбированные агглютинирующие сыворотки применяют в реакции агглютинации на стекле с целью идентификации и изу­чения антигенной структуры микробов.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (рига)

Сущность непрямой, или пассивной, реакции гемагглютина-ции (РИГА) заключается в том, что эритроциты, обладая способ­ностью адсорбировать на себе антигены, становятся «чувстви­тельными» (сенсибилизированными) к соответствующей иммун­ной сыворотке. Под воздействием специфических антител сенси­билизированные эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат. Отличаясь высокой чувствительностью и специфичностью, РИГА позволяет обнаруживать минимальные количества анти­тел и неполноценные антигены полисахаридной природы.

Для постановки РИГА требуются:

1. Сыворотка, подлежащая исследованию.

2. Растворимый антиген для сенсибилизации эритроцитов.

3. Эритроциты.

4. Изотонический раствор хлорида натрия.

Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в пластинках из органического стекла с лунками.

1. Подготовка эритроцитов для постановки РГА. Для по­становки этой реакции пользуются свежими или консервиро­ванными эритроцитами барана, быка или человека, полученными из дефибринированной крови. Из крови берут осадок эритроци­тов в объеме 0,1-1 мл и 2-3 раза отмывают его от остатка сыво­ротки в десятикратном объеме стерильного изотонического раствора хлорида натрия. После каждого центрифугирования (при 2000- 3000 об/мин) надосадочную жидкость сливают, за­меняя свежим изотоническим раствором хлорида натрия.

Отмытые эритроциты могут быть использованы в течение 48 ч в случае хранения их в холодильнике при температуре 3-4°С.

После промывания эритроцитов приступают к сенсибилиза­ции их антигеном. Отмытые эритроциты смешивают с антигеном, количество которого определяется его качеством и способностью адсорбироваться на эритроцитах. Смесь антигена с эритроцитами помещают в термостат на 1-2 ч.

После инкубации взвесь сенсибилизированных эритроцитов центрифугируют, отмывают изотоническим раствором хлорида натрия и из осадка готовят 0,5-1% взвесь эритроцитов для по­становки реакции гемагглютинации. Приготовленная взвесь мо­жет храниться в холодильнике при температуре 3-4°С до появле­ния признаков гемолиза.

Антигены белковой природы адсорбируются эритроцитами очень слабо и поэтому при добавлении соответствующей иммун­ной сыворотки реакция гемагглютинации не наступает.

Для адсорбции крупномолекулярных антигенов белковой природы эритроциты предварительно обрабатывают танином, который уплотняет и изменяет, физико-химические свойства их поверхности и повышает адсорбционную способность. Взвесь эритроцитов (2,5%) в изотоническом растворе хлорида натрия рН 7,2 смешивают с равным объемом раствора танина 1:20000, приготовленного на обычном изотоническом растворе хло­рида натрия, и ставят на 10-15 мин в термостат или водяную ба­ню при 37°С. Смесь центрифугируют, надосадочную жидкостьсливают, а осадок эритроцитов промывают фосфатно-буферным раствором.

2. Постановка реакции. Из исследуемой сыворотки гото­вят ряд последовательных разведений. Приготовленные разведе­ния сыворотки разливают в лунки по 0,5 мл. К каждому разве­дению исследуемой сыворотки прибавляют от 0,1 до 0,5 мл 0,5-1% взвеси; сенсибилизированных эритроцитов. Каждый опыт со­провождается постановкой контролен на отсутствие спонтанной агглютинации (1 и 2) и контролем на специфичность реакции (3 и 4):

1. 0,5мл изотонического раствора хлорида натрия + рабочая до­за сенсибилизированных эритроцитов.

2. 0,5мл изотонического раствора хлорида натрия + рабочая доза несенсибилизированных эритроцитов.

3. Иммунная сыворотка, взятая в разведении, соответствую­щем ее титру (последнее разведение, дающее положитель­ную реакцию в РИГА), Нерабочая доза сенсибилизирован­ных эритроцитов.

4. Нормальная сыворотка, не содержащая специфических ан­тител, + рабочая доза сенсибилизированных эритроцитов. Результат реакции агглютинации учитывают после осажде­ния эритроцитов в контрольных пробирках непосредственно по­сле инкубации в термостате при температуре 37°С или после дополнительного выдерживания при комнатной температуре в течение 18-24 ч.

Результаты оценивают по внешнему виду осадка эритроци­тов в лунках. В положительном случае, обозначаемом знаком +, эритроциты равномерно в виде «зонтика» покрывают почти все дно пробирки или лунки. При отрицательном результате эритроциты оседают в зависимости от дна пробирки в форме компактного комочка, «пуговки».