Хід роботи

Якісний аналіз методом Хатч. Старанно вимийте руки з милом. Відкрийте набір. Не торкайтесь руками внутрішньої частини набору й кришки, оскільки можете занести туди бактерії. Наповніть набір водою, що аналізується, й закрийте кришкою. Зачекайте, поки поживний бульйон розчиниться у воді, потім переверніть набір, щоб внутрішня пробірка наповнилась цим розчином. Простежте, щоб у внутрішній пробірці не було бульбашок повітря. Повторіть процедуру з чотирма іншими наборами. Поставте всі 5 наборів у тепле місце, бажано в термостат при температурі 35 ± 0,5 °С. Через 1 год. знову переверніть набори, щоб видалити бульбашки повітря, яке могло виділитися з розчину внаслідок нагрівання. Поверніть набори знову до термостата.

Якщо протягом 12-24 год. у внутрішніх пробірках спостерігається газ, то коліформні бактерії присутні. Якщо газу немає, поверніть набори в термостат ще на добу. Якщо й протягом цього часу в пробірках газ не утвориться, коліформні бактерії у воді відсутні.

Кількісний аналіз методом Хатч. Проводиться лише при позитивних результатах першого аналізу. Строго кажучи, перший аналіз не дає однозначної відповіді, чи є у воді колі-бактерії, оскільки існують (хоч і рідко) інші види бактерій, що розмножуються в лактозному бульйоні, а отже, викликають виділення вуглекислого газу.

Для порівняння наявності колі-бактеріи та оцінки їх кількості проводиться другий аналіз. Розглянемо його. Відкрийте кришку другого набору Хатч й перелийте вміст першого набору в другий. Переверніть набір, щоб вилучити бульбашки повітря з внутрішньої пробірки. Повторіть цю процедуру з іншими чотирма наборами. Помістіть другий набір у термостат й витримайте його там при температурі 35±0,5 °С протягом 48±3 год. Утворення газу в пробірках свідчитиме про наявність у воді колі-бактерій. їх кількість визначте за таблицею 2.

Метод Мілліпор. Ґрунтується на застосуванні мембранних фільтрів (це тонкі пластикові пластинки з дрібними порами, що затримують всі бактерії з води, яка прокачується крізь ці фільтри). Певний об'єм води прокачується крізь фільтр на поверхню поживної суміші, бактерії розмножуються там і утворюють колонії, які легко спостерігаються неозброєним оком. Кожна така колонія представляє одну бактерію, що була у воді.

У наборі Мілліпор є інструкція, яка роз'яснює, як оцінити загальну кількість бактерій у воді й окремо колі-бактерій. Для полегшення підрахунку колоній застосовується попереднє розведення води, що аналізується, дистильованою водою - набагато легше визначити 10 колоній з 1 мл води, розведеної 99 мл дистильованої води, ніж рахувати 1000 колоній у 100 мл води. Звичайно, при остаточному підрахунку кількості бактерій вводиться поправка на розведення.

Таблиця 2

Кількість колі-бактерій у воді в залежності від утворення газу

Кількість пробірок		Кількість колі-бактерій на 100 мл води
без газу	з газом
0 1 2 3 4 5	5 4 3 2 1 0	Понад 16 16 9,2 5,1 2,2 0

Виявлення соїі-бактерій на середовищі Ендо. Напередодні аналізу приготуйте 10 %-й розчин основного фуксину в етиловому спирті. Профільтруйте його перед використанням. У день аналізу в окрему стерильну пробірку налийте 0,5 мл 10 %-го спиртового розчину основного функсину, до якого додайте 10 %-й розчин сірчанокислого натрію (сульфіт) до отримання яскраво-рожевого забарвлення. Розчиніть окремо 0,5 г лактози в 2-3 мл води і прогрійте протягом 5 хв. на киплячій водяній бані. Потім до 100 мл розчиненого м'ясо-пептонного агару з рН = 7,4-7,6 долийте розчин лактози і весь розчин основного фуксину із сульфітом. Середовище розлийте по чашках Петрі, воно повинно бути кремового кольору.

На поверхню середовища, що застигло, нанесіть 0,1 мл - 1 мл води, яку розітріть шпателем Дригальського. Якщо водойма дуже забруднена органічними викидами, то зробіть розведення води і при підрахунку кількості бактерій врахуйте це розведення. Чашки Петрі поставте на 24 год. у термостат при температурі 43 °С. Проведіть забарвлення препаратів за Грамом. Наявність грамнегативних неспороносних паличок у забарвлених колоніях підтверджує їх приналежність до групи соlі-бактерій.

Підрахуйте соїі-індекс, тобто кількість соlі-бактерій, що знаходяться в 1000 мл води, та соlі-титр, тобто кількість мл води, в якій міститься 1 бактерія. Охарактеризуйте рівень забруднення водойми, враховуючи таку градацію:

соlі-титр = 100 - вода чиста,

соlі-титр =10- вода придатна для пиття,

соlі-титр = 0,1- вода непридатна для пиття.

Непридатною для пиття вважається також вода, що містить в 1 мл 100 і більше сапрофітів.

Виявлення Е. соїі методом мембранних фільтрів. Метод підрахунку бактерій на середовищі Ендо дозволяє виявити групу соlі-бактерій.

Через фільтр діаметром 30 мм пропустіть 300-500 мл чистої води або 1-10 мл розведеної у 100 разів брудної води (що відповідає 0,01-0,1 мл води досліджуваної водойми) так, щоб на фільтрі було не більше 50 колоній Е. соlі. Після фільтрування візьміть фільтр стерильним пінцетом і помістіть його фільтруючою поверхнею догори на агарове середовище Ендо тісно притискаючи його до поверхні.

Через 24 год. інкубації при 37 °С приготуйте із забарвлених колоній препарати і зафарбуйте за Грамом.

Якщо у препаратах відсутні грамнегативні неспороносні палички, це свідчить про відсутність Е. соlі. Якщо такі колонії присутні, проведіть посів у бродильних посудинах або у пробірках із поплавками, в які помістіть 10 мл глюкозо-пептинового середовища.

Помістіть пробірки в термостат при температурі 43°С на 24 год. (ця температура не дозволяє розвиватися звичайним сапрофітам). Про присутність цієї палички судять за інтенсивністю газоутворення.

1 л глюкозо-пептинового середовища містить 10 г пептону, 5 г NaCl, 5,5 г глюкози, рН = 7,4 - 7,5. Проведіть стерилізацію середовища плинною парою.