Ц ентрифугирование (Седиментация)

Диффузия

Моментальный процесс микроскопического переноса вещества. Процесс, при котором возникают макроскопические потоки.

Моментальный в том смысле, что у него нет движущей силы!

В электрофорезе движущая сила – сила Кулона. В хроматографии – гидравлический поток.

А в диффузии ВИДИМОЙ внешней силы нет.

Диффузия – процесс выравнивания концентрации (градиент).

Пусть у нас есть 2 зоны с разными конентрациями, и пусть частицы движутся хаотически, и зачет того все векторы движения равновероятны, в т.ч. и через границы зон, зоны перемешаются

При абсолютном нуле диффузии быть не может, т.к. нет броуновского движения!

Вероятность преодолеть границу зоны одинакова, но соотвественно число молекул идущих из зоны большей концентрации больше.

1-й Закон фика. n = -D grad(C) ( в одномерном случае n = -D dC/dx )

n - поток (кол-во в-ва, переносимое через 1 площади в 1 времени)

D - коэффициент диффузии (размерность м²/сек)

В общем-то очевидно. Диффузионный поток, количество частиц в единицу времени, пересекающий единицу площади, пропорционален грудиенту концентрации, т.е. локальной разнице концентраций.

Одномерный случай – если каплю вещества поместили в другое вещество.

Первый закон хорош для стационарной диффузии, когда концентрации не меняются.

2-й закон Фика

Более сложный случай – для движущихся систем

Для изменяющихся концентраций.

Предельный случай – выравнивание концентраций по всему объему.

Опыт; на слой медного купороса наслоили столбик воды. Образуется резкая граница. Через день уже нет резкой границы. Через год перемешается.

На вопрос, как быстро происходит изменение концентрации, отвечает второй закон Фика.

dC/dt = D * d²C/dx² (для одномерного случая) - диф. уравнение 2ого порядка L

Скорость изменения концентрации пропорциональна 2-й производной концентрации.

Выглядит правдоподопно

Фактически, пропорциональна скорости изменения потока.

Посмотрим решение простых случаев.

Пример решения для случая когда на раствор наслоили равный объем растворителя:

Этот вид хорошо аппроксимируется расределением гаусса

Этот вид абосолютно универсален.

Например, проводи ГЭФ. Нанесли образец в виде зон с резкими границами, в идеале (2 раза такая картинка).По мере движенияв геле граница размывается – засчет диффузии в геле, а конвекцию мы подавили.

Какой формы будет зона при выходе из геля?

Все аппроксимируется распределением Гаусса.

Задачка. Создали линейный градиент концентрации Поток равен углу наклона k. (производная линейной функции).

Соответственно, по второму закону скорость измененения потока равно 0. Система должна быть вечной???

Есть другое объяснение - она не равновесна.

Полуается, в равновесных системах поток изменяется.

Что неправильно? У нас не бесконечные концентрации, должны быть краевые условия.

У нас есть краевые условия. Иначе, система должна быть, что со дна в-во удаляется, а на поверхности накачивается. На краях не соблюдается равновесие.

Процесс динамичного равновесия.

Коэффициент диффузии.

При прочих равных условиях, при заданном градиенте концентрации определяет скорость диффузионного потока.

Естественно, зависит от свойств частиц.

Более-менее строгую аналитическую зависимость можно выявить только для сферических частиц.

при бесконечном разбавлении (С->0), k - пост. Больцмана, T - температура, f - коэффициент вязкого трения

А в свою очередь к.в.т. связан с радиусом частицы по закону вязкого трения.

Закон стокса для сферических частиц

h-вязкость среды

И еще предполагается бесконечно разбавленный раствор.

Как от радиуса перейти к мол массе? С радиусом связан объем.

Введем понятие Удельный парциальный объем. Величина, обратная плотности.

Внутри класса (белки, НК) эта величина более-менее постоянна – почти плотность.

Это вольное допущение. При переходе между классами это уже сомнительно. НО! Во многих учебниках допускается использование уд V, потому что БП состоят из одних и тех же атомов – Н, С, О, связи практически одинаковы, но понятно, что это уже более скользкая апологетика.

Уже от объема можем легко перейти к М – умножая на плотность.

Коэффициент диффузии уменьшается с ростом массы но не очень быстро (³√). Даже для крупных молекул диффузией пренебрегать нельзя.

Соединение	M	D см2/сек х107
Глицин	75	95
Цитохром C	13.000	10.1
Пепсин	35.000	9.0
Карбоксигемоглобин	68.000	6.2
Уреаза	480.000	3.5

Уреаза – самый крупный известный белок. А коэффициент диффузией меньше всего в 30 раз по сравнению с глицином.

СЕДИМЕНТАЦИЯ

СОЭ – самый типичный пример.

Седиментация проводится в условиях бесплатно выданного нам поля всемирного тяготения)

Но в условиях эксперимента хотелось бы иметь поле, величиной которого можно управлять.

Сведберг (Нобелевская премия) придумал использовать ц\ф в научных целях

До него ц\ф проверяли, например, жирность молока.

Пробирка, закреплена в устройстве, вращается вокруг оси, радиус вращения параллелен длине пробирки.

Из физики: движение по окружности всегда движение с ускорением.

Центробежная сила неправильно. Силы как таковой нет, просто сумма всех сил не равно 0, поэтому движение с ускорением. Более правильно – центростремительное ускорение.

Как ни называй, эффет один и тот же. Если мы на какой-нибудь детской карусели, нужно за что-то схватиться – испытываем большую силу реакции опоры. Иначе покинем зону вращения.

Результирующая сила направлена к центру и обеспечивает центростремительное ускорение. Пропорциональна квадрату частоты вращения и радиусу.

Из чего складывается результирующая сила? Сила Архимеда – сила, действующая на тело в жидкости, если плотность жидкости отличается от плотности тела. Сила вязкого трения – для всего, что движется в жидкости.

сила вязкого трения:

сила Архимеда:

m - масса частицы, r - радиус вращения, w - угловая скорость вращения, n - удельный парциальный объем частицы, r₀ - плотность растворителя v - скорость перемещения частицы от центра вращения (dr/dt) )

Поему сила вязкого трения вбок? Частица движется ко дну. А соответственно направлено в противоположную сторону.

Скорость в – движение от центра вращения ко дну пробирки, dr/dt.

Сила Архимеда включает массу растворителя в объеме частицы, и центростремительное скорение. (в частном случае, когда только земное тяготение - g)

- объем частицы.

Не путать скорость и объем в обозначениях!

V, направленная вниз - dr/dt.

Если сила Арх полностью обеспечивает силу – частица не движется, она равновесна.

Надо определить параметр разделения. – Скорость седиментрации (СС).

В эксперименте мы можем мерять скорость движения частицы ко дну – собственно СС.

С какими параметрами частицы мы можем ее связать – коэффициент седиментации (КС)

Преобразуем выражение, чтобы у нас с одной стороны были условия эксперимента (то, что мы контролируем), а с другой- параметры частицы, которые мы контролировать не можем.

Коэффициент седиментации : 1S = 10^-13 сек

К самой частице относится коэффициент седиментации (в Сведбергах).

Скорость пропорциональна r.

Плохо, что КС непрозрачно связан со свойствами частицы.

Вроде связан с молекулярной массой. Но совсем не так. Плохо, что связан с УПО. Но можем сказать, что внутри класса он все равно константа, так что пронего можно забыть, хотя это очень приближенно.

Кроме того присутствует коэф вязкого трения, который зависит от радиуса – плохо.

Короче, зависимость от массы непропорциональная и непрямая.

ГРУБО можно сказать, что КС пропорционален отношению массы к радиусу.

Оговорка, что только для сферических частиц. И это отношение не постоянно даже для частиц внутри одного класса (поправка на ³√)

Но это выражение все равно нам нужно, из него мы можем вытащить условия для изопекнического (равновесного) ц/ф. Если произведение УПО и плотности частицы равно 1, то КС=0, и никуда частица не идет, а остается на месте.

Преобразуем, получаем более явную зависимость.

КС пропорционален квадрату радиуса

Если плотность вещества равна плотности растворителя, то у нас будет изопекническое ц/ф.

При определенной угловой скорости (УС) измеряем КС астицы;

Чтобы сравнивать КС разных веществ, результаты разных экспериментов в разных условиях, используем КС, приведенные к стандартным усл.

Если эксперимент не в воде, то должны нормировать на плотность коэф. вязкости (из уравнения Стокса) нового растворителя.

Стандартные условия - в воде, при 20º.

Как определит КС из экспреимента?

Преимущество – работает для всех веществ, вне зависимости от размеров молекул. (к примеру, э\ф- от 100 до 10000 п.н.). Главное, чтобы не диссоциировали в процессе.

Хоть гвозди и маленькие насекомые.

Митохондрии – 50000S.

16S рибосомные РНК – используются для построения филогенетических деревьев.

Вывод первого уравнения Сведберга.

Оно нас разочарует.

Как избавиться от коэф вязкого трения? Самсвдберг предложил. Он связан с коэф диффузии. Подставим, получится простое выражение, которое можно переписать относительно молекулярной массы.

Нам не хватает коэф диффузии. Одного эксперимента по скоростной седиментации не достаточно – нужен эксперимент по измерению коэф диффузии. А это сложно и дорого.

Или можно использовать второе уравнение Сведберга

Можно использовать равновесную седиментацию, тогда мы обойдем поиск D.

Вернее эксперимент по определению D неявно включим в наш эксперимент.

Скорость увеличивается при приближении ко дну – неровное распределение. Та же проблема, что и при э/ф – неравномерная информационная нагруженность. По мере увеличения r увеличивается объем неиспользуемо области

Долго ведем седиментацию однокомпонентного раствора. Частицы оседают на дно согласно законам скоростной седиментации.

Если у нас истинный раствор, не образуется осадок, вещество не сорбируется на стенках → установится равновесие. По мере того, как частицы продвигаются ко дну, создается градиент концентрации, концентрации в областях расстояний больших от оси вращения – больше.

Возникает дифф поток, который пропорционален градиенту концентрации, но направлен в другую сторону от седиментационного. Они становятся равны в какой-то момент

Дифф поток пропорционален градиенту концентрации, с коэффициентом диффузии, но с минусом.

Градиент концентрации очень нелинейный. Даже более нелинейный, чем экспоненциальная функция. Сначала растет очень медленно, по мере приближения ко дну сильно возрастает.

Предположим, доводим до состояния равновесия, когда концентрация уже не меняется. Есть 2 концентрации, С₁ и С₂, соответствующие 2-м радиусам.

В лог подставляем S из 1 ур-я Сведберга

2Е уравнение Сведберга

Случится нечто радостное - сократится ненавистный коэффициент диффузии. Так как мы поставили эксперимент так, диффузионный поток по условию равен седиментационному. Т.е., попутно мы определили коэффициент диффузии.

Осталась последняя проблемная величина – УПО.

Нобелевку Сведбергу дали в том числе и за это.

На самом деле, практического применения такой способ определения М не имеет. Особенно сейчас, когда есть более прогрессивные методы.

Что в таком методе плохо?

1. Нам нужно создать равновесную систему. Есть белок, и сколько такого белка потребуется для эксперимента даже в очень маленькой пробирочке?

2. Если разница концентраций такая, что мы ее можем достоверно зарегистрировать, то в зоне высоких концентраций белок образует нерасворимые агрегаты, т.к. концентрация слишком высока.

Но в принципе для определенных М можно применять равновесное центрифугирование, и редко, но используют. Чаще сейчас ее используют для создания градиента, для определения плотности веществ, в варианте, когда центростремительное ускорение полностью обеспечено силой Архимеда.

КАКАЕ свойства веществ мы можем определять

1. молекулярная масса - редко

2. плотность (изопекническое ц/ф, создаем градиент плотности, и какое положение в нем займет наше вещество. F_тр вклад не вносит)

3. коэффициенты седиментации (сейчас есть КС почти для всего, даже для надмолекулярных структур.)

Разновидности ц\ф

Урановые центрифуги в шахтах – требуют запретить.

Легенда о первой советской центрифуге, построенной Сведбергом, в подвале Курчатовского института

1. Скоростная седиментация

А. объемная скоростная

В 1-й пробирке все разделяемые компоненты. Более тяжелые, естественно, опускаются первыми

Компоненты однородного образца движутся ко дну с разными скоростями. Неполное разделение: легкие частицы придонных слоев осаждаются раньше тяжелых из поверхностных;

Очистка легких компонентов от тяжелых, когда осадок обычно не нужен. Но со временем легкие компоненты тоже уходят в осадок!

Хороший метод очистки жидкостей от тяжелых компонентов, которые не образуют истинных растворов и имеют ↑КС.

Если очистка легких от тяжелых, то часть легких теряем, засчет того, что изначальные расстояния между частицами и до дна были небольшими. Когда потери несущественны, можно использовать

А если нужно отделить все? И если в том нужен числе чистый осадок?

Б. Зональная скоростная седиментация

Образец наслаивается в виде зоны. Чаще всего используется наслаивание на среду с градиентом плотности для уменьшения конвекции и расширения диапазона разделения;

Может произойти разделение зон еще до того момента, как частицы достигли дна.

Минус – более сложные манипуляции по постанове эксперимента.

И меньшая нагрузочная способность.

Например, выделить вирусы из клеток, а попутно можно отделить целые клетки, ядра и т.д.

2. Изопикническое (равновесное) центрифугирование

в градиенте плотности, охватывающем диапазон плотностей разделяемых частиц.

С оздать градиент можно с помощью равновесного ц/ф: сначала долго ц/ф раствор веществ, из которых мы хотим создать градиент, а потом нанести нашу смесь. Можно создать градиент заранее, используя градиент миксера, например. Обычно используется преформированный градиент из 2-х ступеней, концентрированный раствор веществ, градиент и растворитель, и некоторое время ц/ф. Или это центрифугирование идет одновременно с разделением.

Главное не допустить осаждения на дно интересующих нас веществ, пока градиент не создан.

Типы градиентов: полностью или частично преформированные либо создаваемые в процессе центрифугирования.

Каке в-ва используются для создания градиента?

Для начала надо рассмотеть плотности веществ, которые мы хотим разделять

	сахароза	CsCl	Cs2SO4	NaI
дцДНК	1.42	1.69-1.74	1.42-1.45	1.52-1.58
РНК	1.49	>1.9	1.61-1.66	1.57-1.68
Белки	1.24-1.32	1.30-1.33
Хроматин	1.36	1.30-1.33 (H2CO)
Рибосомы	1.41	1.384 (H2CO)	1.46-1.48
Лизосомы	1.21
Митохондрии	1.19
Мембраны	1.13-1.18

Самые плотные – НК.

Надмолек комплексы – менее плотные.

Для НК можно использовать соли тяжелых щелочных металлов или соли тяжелых галогенов, или и то, и другое. Недопустимо для надмолекулярных комплексов – т.к. это сильные хаотропные агенты, и просто приведут к разрушению комплексов.

Соли Cs+, I- (rнасыщ: CsCl: 1.91, Cs2SO4: 2.01, NaI: 1.90, KI: 1.72)

Для комплексов надо использовать что-то более мягкое. Используем принцип «подобное в подобном» - глицерин, сахароза. Но главное, вещества д.б. растворимыми, чтобы достигать высоких плотностей. Но при таких концентрациях это у же перестает быть раствором, и становится скорее сиропом. Плотности в итоге небольшие, а хотелось бы больше.

Глицерин: 1.01( 5%)à1.13(50%)

Сахароза: 1.02( 5%)à1.23(50%)

Чтобы получить большие плотности, на основе сахаридов было разработано несколько веществ специально для формирования градиентов плотности.

Например, Метризамид: 1.05(10%)à1.44(80%) C

«Нам нельзя ничего такого страшного, ионогенного и хаотропного»

Чтобы не увеличивать УПО, введем несколько тяжелых атомов, а для того, чтобы удобнее было их вводить, введем бензольное кольцо. Плюс несколько заместителей, чтобы вещество было стабильным, незаряженным и гидрофильным.

Можно использовать макроскопические частицы, т.к. при ц/ф нет ограничений на размер частицы. Для создания градиентов можно использовать не истинные растворы, а суспензии очнь мелких частиц.

Например, фекол (коммерческое название), по сути мелкодисперсные частицы кремния, покрытые гидрофильной оболочкой, которая обеспечивает стабильность существования такой системы. Percoll (10-20мкм SiO₂ + поливинилпироллидон)

Раньше изопикническое ц/ф использовалось для получения чистых суперскрученнных плазмид. – минус в том, что использовался EtBr с УФ, что портило ДНК.

Если ьудем проводить ц/ф разных форм ДНК в присутствии EtBr, тот будет интеркалировать, а коэффициент интеркаляции сильно меняется в завиимости от того, есть супервитки, или нет. Если есть топонапряжение, EtBr может интеркалировать значительно больше. И уменьшается плавучая плотность, т.к. он сам легкий. И плотность релаксированной формы и сперскрученной будет сильно различаться, с помощью визуализации это можно выявить. Зону можно отбрать с помощью шприца.

Но потом его надо извлечь.

Можно использовать даже для выдел органелл – митохондрий,хлоропластов. Их плавучая плотность отличается от плотности остатков разруш клеток. А плавучую плотность использовать удобно, процесс равновесный, похоже на равновесные процессы, где происходит самофокусирование (например, изотахофорез).

А хроматин имеет очень высокую плотность – ядра тоже легко выделять. Даже градиент не требуется, только подушка. Ядра в осадке, остальные органеллы на подушке.

Очень неплотная фракция – мембраны. Хлороплаты и митохондрии (геномсодержащие) примерно посеридине.

Можно использовать комбинацию изопекнического и скоростного ц/ф.

А рибосомы где? Их трудно от хроматина очистить. Можно отделить зональным скоростным ц/ф. Или можно сначала полисомы выделить. Или изопикническим можно отделить неразрушенный ЭПР.

Ц/ф уникально тем, что можно использовать любые буферы.

Типы центрифуг.

Нужно обеспечить пост центростремительное ускорение – главное, что требуетсяот центрифуг. Т.е. обеспечить контроль над угловой скоростью вращения пробирок.

Сведберга не было в проекте, а ц\ф были. Американский патент 1892 года – для разделения сливок и масла из молока. «Шарманка с ручкой»

Части центрифуг:

Ротор – сама важная часть, куда мы помещаем образцы

Привод. Обеспечивает контроль над угловой скоростью. В первых центрифугах это был «шарманщик». Кроме того, контроль над разгоном и торможением.

Корпус. Если ротор окажется непрочным и корпуса не будет, оператор пострадает. «Шрапнель»

Температуру тоже надо контролировать – холодильник и камера охлаждения. Треньем о воздух нельзя пренебрегать, выделяется тепло. В совсем хороших ц/ф даже ротор охлаждается.

И еще вакуумный насос.- для неаналитич ц\ф.

Есть особый класс ц/ф - аналитические – с он-лайн спектрофотометром. Фактически ц/ф кювету. И можем сразу в процессе измерить коэффициент поглощения.

Сейчас аналитическими обозначают маленькие настольные ц/ф для нельших порций вещества, в противовес препаративным.

В одном из институтов в Ельцовке стоит такой монстр – советская аналитическая ультра ц/ф. Вынести ее трудно, вот и стоит. Это устройство тех времен, когда денег, тем более на науку, не считали.

Сейчас это никому не надо, можно довести эксперимент до равновесия, а потом просто пропустить чрез спектрофотометр перистальтическим насосом, отбирая отдельные фракции из пробирки. Это дешевле.

Полностью экипированную называют ультра.

Наши – маленькие, попроще. Настольные. Называют тоже аналитическими, но зачение другое.

Поллупрепаративные, куда можно поместить стаканы больших объемов.

Препартивные.

В больших центрифугах ротор никак не крепится, а просто держится на стержне. Вот это баланас!

Скорость вращения – до 100000 g. У космонавтов перегрузка – до 10 g.

Проточная центрифуга часто используется в промышленности (непрерывная подача материала в процессе эксперимента) В каждом фермерском хозяйстве – сепаратор. Отделение жира от молока.

Промышленные, проточные осадительные, система «жидкость-твердые тела» – отгон жидкостей от осадка, например, в горно-обогатительной прмышленности.

Фильтрующая ц\ф. Имеет вставки – фильтры, для очистски от мелких частиц. Размеры пор заданы под размеры частиц.

Осветляющая. Фильтр жидкости. Например, в ЗИЛ-е, он гудит после долгой езды, там подобная ц/ф для очистки масла. После выключения двигателя она еще долго останавливается.

Характеристики ротора.

Предельная характеристика ротора – максимально возможная частота вращения, угловая скорость в об/мин. Она же определяет максимально возможную величину центростремительного ускорения. измеряется обычно в отношениях к ускорению свободного падения - g

Скорость зависит от размера радиуса движения, и по мере приближения ко дну частицы ускоряются – отношение макс радиуса и мин радиуса характеризует неоднородность поля центростремительного ускорения, по длине пробирки. При чем, чем меньше неоднородность, тем лучше.

Центростремительное ускоренияе линейно возрастает от ω2r_min до ω2r_max .

Иногда в зональной скоростной используются градиенты плотностей, но это не делает ц\ф изопикническим. Неоднородность используется просто для замедления, чтобы недать частицам осесть на дно и болееэффективно разделить.

Типы роторов