Э/ф а св.ср – редко. В гелях много чаще.

Электрофорез в агарозном геле

Гель –поддерживающая среда. Исключает минусы э\ф в жидкости: устраняет конвекцию, подавляет диффузию.

Агароза – особо чистая фракция агара (природный линейный полисахарид). Агар тоже используется. И даже желатин. Фракция по возможности не содержит заряженных частиц и а/к фрагментов.

Агар = Агароза + Агаропектин (содержит значительное количество полипептидов)

При затердевании – образуется гель, нити скрепляются множественными водородными связями. Связи нековалентные, поэтому процесс обратим.

Агароза не заряжена, не содержит а\к фрагментов.

Среди бок радикалов содержатся боковые заряженные группы, например, сульфогруппы.

до 6% -SO₃- в основном в Агаропектине.

Если будет много таких групп, будет эндосмоз. НК будут двигаться в обр. сторону => сильное замедление. А иногда даже двигаютсяв другую сторону.

Размер пор геля зависит от концентрации.

Для нуклеиновых кислот вирусов и крупных плазмид– 0,4 – 0,5; ДНК в 5-20 тыс п.о.- 0,7 – 0,8; для более коротких рестриктов ДНК и двунитевых РНК вирусов – 1,5; для рибосомальных РНК – 1,75, для ДНК 1000 п.о.- 2%.

Измерение радиуса пор– с помощью гемоглобина, вирусов. Измерение проводили в агаре, но радиус пор различаются несущественно.

Схема умозрительная, реально используют 0.5 – 2% гели.

2% Гель – хрупкий, и почти непрозрачный, использовать сложно.

Гель с концентрацией меньше 0,5 затвердевает только при +4, механически непрочен, но почти полностью прозрачен.

Агарозу можно расплавить, экстрагировать, выделить б\п.

Краситель – бромистый этидий (1 мкг на мл). Хорошо окрашивает ДНК и РНК, особенно двунитевые. Краситель желтый, флюоресцентный. Положительно заряжен, взаимодействует с фосфатными группами. Способен интеркалировать между оснований - с увеличением эффективности свечения. Чувствительность – 0,01 мкг ДНК.

Есть особые сорта, которые легко разжижаются – LMT (low melting temperature), даже при небольшой температуре – 37-40º

Электрофорез в акриламидном геле

Акриламид СН₂ = СР – СОNH₂ . Сшивки – «Бисом»

Гель с небольшими порами.

Линейный полиакриламид – вязкая масса, сироп – длинные нити (для этих же целей используется машинное масло в бензине в двигателе), но это все еще раствор, а не гель

Для затвердевания добавляют NN’-метиленбисакриламид – ковалентные поперечные сшивки. Затвердевание – необратимый процесс, т.к. происходит полимеризация (свободно-радикальная).

Размер пор зависит не только от концентрации мономера, но и от соотношения мономера и сшивающего агента и основного полимера, т.е. определяется частотой расположения сшивок и концентрацией основных нитей.

Чтобы сделать полимеризацию хотя бы частично обратимой, для экстракции БП, используют другие поперечные сшивки.

Например, эфирная связь используется для введения мостиков. Потом эфир можно гидролизовать инкубацией при больших или при низких рН. Хотя это жесткие условия для БП.

Можно использовать карбоксигруппы и ОН-группы. Когда рядом много таких структур, они легко окисляются. Такие связи гидролизуются перейодатами, перманганатами. Хотя это все равно очень жестко.

Заряжен.?

Акриламид быстро гидролизуется – на аммиак и акриловую кислоту. Аммиак улетает, рН смещается в кислую сторону. Автокаталитический процесс. Процесс идет очень быстро, но начинается медленно.

Содержание водной фазы – от 70 до 97%.

Хорошо прилипает к чистому стеклу.

Могут использоваться другие амиды.

Практически важно управлять полимеризацией. После того как смешали акриламид, бис, катализатор и источник свободных радикалов, должно пройти время, чтобы переместить гель, а потом пройдет небольшое время, для формирования геля, чтобы использовать.

Источник свободных радикалов – перекисные соединения, чаще всего персульфат аммония.

Если хочется контролировать, можно использовать систему рибофлавин-свет. Контроль – освещением.

В качестве катализатора используется ТЕМЕД.

Механизм катализа не до конца изучен. И если честно, его никто и не стремится особо изучать. Просто эмпирически известно. Увеличивать скорость нужно, т.к. персульфат – ионогенная примесь, внесение его в большом количестве нежелательно, т.к. меняет состав буфера.

Еще проблема – извлечение геля из системы.

Г

Cl₂Si(CH₃)₂

ель полимеризуется между 2-м стеклами или пластинами из прочного полимера. Потом поверхности делаются гидрофобными с помощью производных силана. Он присоединяется к стеклу засчет разрыва связей Si Cl. Входит в состав стекла. И в результате стекло становится покрытым не ОН-группами, а гидрофобными.

Наоборот, нужно ковалентно присоединить гель к стеклу; Например, у нас 3% гель, уже скорее слизь, а не гель, и его механически свойства недостаточны удобны для манипулирования – тоже присоединяют к стеклу с помощью производных силана, только в боковых группах – производные акриламида (вместо СН₃). В 2 стадии: сначала к стеклу присоединяется агент, а потом уже гель.

Или присоединяется гель к силану через эфирную связь.

КАК бы сделать более регулярный матрикс геля? И как бы сделать процесс формирования геля более воспроизводимым?

Можно использовать не акриламид, а специальные заранее приготовленные крупные блоки с большой молекулярной массой. Сначала проводим неглубокую полимеризацию. Выделяем более-менее гомогенную фракцию, например, 10 звеньев акриламида и 1 биса. И будем продавать. Коммерчески более выгодно. Кроме того, получается более однородный матрикс, дольше хранятся, меньше гидролизуются.

ПААГ нужен для диапазона небольших пор. Диапазон – единицы.

К сожалению, диапазон 5-20 не перекрывает никто((((

Зависимость (размер пор-концентрация) зависит от концентрации мономеров и сшивающего агента и носит парадоксальный характер. До определенного увеличения концентрации сшивающего агента (1/20) размер пор уменьшается. При дальнейшем увеличении доли сшивающего агента, больше 5% - образуются островки, микродефекты, кристаллизация – неравномерная полимеризация, и микрообласти гля образуют почти твердые тела, где вообще нет пор, а вокруг них концентрация геля резко уменьшается. И как следствие – резко увеличивается средний радиус пор.

Значит, не стоит использовать более 5% по массе «биса» не следует. Используют 1/20, 1/30.

Частично диапазон больших единиц-нескольких десятков ( нм????) можно перекрыть комбинацией линейного ПААГ с агарозным гелем. Можно приготовить линейный ПАА и добавлять в агарозу – для создания дополнительных компартментов нитями ПАА в агарозе и оказыания сопротивления движению в-ва. Поры меньше, чем в агарозе, но больше, чем в ПААГ

В некоторых системах используется линейный ПАА, для имитации геля. Например, система капилл. э\ф, в капилляре используется псевдогель, виртуальный гель. Реальный гель из капилляра удалить не удастся, капилляр получится одноразовый, что непрактично.

Из 20% ПААГ можно делать фигурки, но они долго не живут.

Будем рассматривать Э/ф нуклеиновых кислот.

ДНК больше 100кБ не разделяются

Электрофорез в других гелях

Почему нельзя полиэтилен? Сильно маленький, но более химически устойчив и к тому же гидрофобен. Но существует пористый полиэтилен, мутный и темный. И к тому же этилен – газ.

Какие еще мономеры можно взять?. Должны быть вещества с сильной гидрофильностью (чтобы манипулировать в водных растворах) и желательно незаряженное.

Поэтому акриловую кислоту нельзя использовать, заряжена. А вот воду опреснять ею можно (эндоэлектроосмос)

Зависимость подвижности от М и размера пор геля

Для примера, рассмотрим э\ф НК.

Э/Ф в свободной среде их фракционировать не получится.

В случае геля размер молекулы имеет большее значения, вносит больший отрицательный вклад в подвижность, из-за трения о матрикс геля. Понятно, что это происходит только в том диапазоне М, для которых это трение существенно.

Зависимость подвижности от молекулярных масс имеет линейный участок в логарифмических координатах.

Подвижность относительная.

u ~ -k log(M)

Зависимость подвижность-масса, линейный участок в логарифмических координатах. Но в крайних областях зависимость не сохраняется. В области малых размеров подвижность от размера не зависисит (практически э/ф в свободной среде, трение о матрикс не вносит вклад в торможение). В области высоких молекулярных масс подвижность не равна 0, но и не изменяется. Почему, обудим позже.

Никакой разницы между 10 и 100 кбаз не видно, но ДНК все равно мигрирует.

Рекомендуют при выборе концентрации оставаться в об-ти лин участка.

дцДНК:

0.3-0.5% агароза от 5 до 100 kB

1% агароза от 0.2 до 5 kB

2% агароза от 0.1 до 2 kB

4% ПААГ от 50 до 1000

8% ПААГ от 20 до 600

20% ПААГ от 5 до 100

Для сравнения результатов э/ф в гелях с разным процентным содержанием матрикса:

Ур-ие Фергюссона

log(u) = log(u₀) – Kr Cгеля

Линейный характер логарифмов в диапазоне линейных зависимостей можем вывести линейную зависимость подвижности образцов от %-ного содержания геля

Зависимость эмпирическая

{Большие 100-ни нукл пар дцДНК – кольцо, меньше – упругий стержень}

Физико-химическая (механическая) модель взаимодействия ДНК и матриксом геля

Люди строили эмпирические закономерности, измеряли подвижности разных молекул в гелях, смотрели разныекоординаты, и обнаружиди, что в логарифмичесих координатах – линейный участок. Удобно. Почему – непонятно.

статья

Сделали специальную молекулу ДНК: стержень с изгибом (в релаксированном состоянии), можно варьировать изгиб и его положение. Смотрели как влияет изгиб на подвижность. Как оказалось, изгиб в центре больше всего влияет. Что разумно, чем больше диаметр цилиндра, темсильнее трение о матрикс. Но зависимость не непрерывная, парадоксальная.

u = {h²} Q / (L² f)

Зависимость подвижности от величины изгибы – не непрерывная и парадоксальная. При достижении определенного угла изгиба зависимость менялась скачкообразно

Следующая часть эксперимента – ввели 2 изгиба, и исследовали влияние их взаимной ориентации, от цис положения до транс. Подвижность зависит. Транс обладает большей подвижностью.

Дошли до формулы: u = {h²} Q / (L² f)

длина фрагмента, контурная длина фрагмента, контурная длина для замкунутой малекулы ДНК равна 0. → для плазмид и других кольцевх молеклл не используются

Практические аспекты: приборы и системы

Для приготовления ПААГ нужна герметичная система: т.к О₂ – ловушка радикалов, и ингибирует реакцию радикальной полимеризации. Также перед полимеризацией рекомендуется проводить дегазацию – чтобы удалить О₂.

ПРОБЛЕМА №1: подразумевается детекция по окончанию.

Большая часть системы используется неэффективно (с точки зрения информационной нагрузки): большая часть заполнена небольшими фрагментами, между которыми очень большие расстояния, которые хорошо разрешаются. А относительная подвижностьизменяется сильно, из-за того, что молекулярная разница здесь большая.

Например, 20 и 21 хорошо разделятся. А 500 и 501 – уже плохо.

Чтобы решить эту проблему, нужно создать неоднородную среду, увеличивая подвижность коротких и уменьшая подвижность длинных.

Стандартный способ – неоднородные гели (ех, по толщине) Это приводит к тому, что напряженность электрического поля здесь тоже неоднородна, поскольку проводимость пропорциональна толщине, а сопротивление обратно.

(Скорость = подвиж*напряж)

Или можно использовать неоднородные по концентрации буфера или геля – более сложно выполнимо. Концентрация буфера в нижней части должна быть выше, тогда напряженность поля ниже. Или концентрация геля выше, при этом напряженность даже выше, но резко увеличивается трение матрикса. Или использование комбинированных вариантов.

Когда требуется выйти за пределы молекулярных масс, которые эффективно фракционируются ПААГ и агарозными, область коротких фрагментов – до 5 п.о., но верхний предел – 100 тысяч п.о.

Например, разделить хромосомы так не получится. Но хочется!

Решение. Электрофорез в пульсирующем поле – на короткое время знак вектора напряженности меняется на обратный; вместо постоянного непрерывного движения молекула как бы раскачивается.

Тогда диапазон линейной зависимости в логарифмических координатах можно продлить в сторону больших молекулярных масс, причем далеко – до размеров мелких хромосом, геномы пластид, митохондрий

Далее метод совершенствовался чисто технически

Сумм интеграл направления импульсов должен быть направлен в нужную сторону

В первых вариантах, при неизменной скважности (т.е. импульсы одинаковые по времени, прямые и обратные), просто были импульсы разные по величине.

В следующих модификациях метода импульсы были одинаковыми по величине, менялась скважность.

С амый лучший результат достигается тогда, когда напряженность не просто меняет на обратное, а на различное. Самый эффективный вариант, если вектор описывает фигуру «сердцем » (в полярных координатах). Понятно, чтобы добиться такого эффекта, нужны камеры, которые содержат много электродов. Электроды должны быть подключены к контролеру.

Первоначально за него был лаборант с рубильником.

Сейчас может быть много электродов, управляется компом, напряженность пробегает во всех направлениях

Такая процедура позволяет разделять НК в размере сотен, причем больших сотен.