Разбор задач

Удельная активность не изменяется по закону РР! И коэффициент изотопного разбавления тоже!

По-хорошему, при изотахофорезе подвижность зависит только от лидирующего катиона! Можно считать, что остальных просто нет.

«Улыбка». Проводимость - обусловлена буфером, а он электролит 2-го рода, и сростом Т проводимость увеличивается – не работает объяснение, т.к. у нас фактически все участки геля подключены параллельно, и напряженность одинакова. А вот ток разный – и он усугубляет эффект: дополнительно разогревает гель. И гипотеза с диффузией тоже не работает – только увеличивается ширина зоны, а максимум не меняется.

В денатурирующих условиях эффект выражен не так сиьно – все нековалентные оболочки истончаютсы при нагреве., диапазон уже ниже априори.

Советские кипятильники – электролиз воды, аналогично.

5*10-7 М – шириа дорожки э/ф

Сорбенты: МЕРК (фирма-разработчик) предложили такую разветвленную поверхность, и еще и увеличить доступность групп, чтобы лигандам не было необходимости даже диффундировать к поверхности сорбента. Технология щупалец. Длинные линкеры, к которым присоединяются группы обеспечивающие эффект сорбента, например, длинные углеводородные цепочки. В некотором роде, аналог ж-ж Х с обращенными фазами. У таких сорбентов при том же качестве разделения будет большая скорость, т.к. равновесие будет наступать быстрее. Характерный радиус диффузии намного меньше.

Тверды сорбенты исторически характеризовались размером пор. Исторически использовалась шкала сит. В разных странах разные шкалы!!! Сечас просто указывается размер пор.

Некоторые примеры разных видов хроматографий: классификация по ф/х свойствам сорбентов.

Адсорбционную хроматографию на силикагеля рассматривать не будем.

Г ель-фильтарция

Никаого химического взаимодействия не происходит, считается, что сорбент инетрный. Разделение происходит из-за того, сорбент имеет поры разного размера. Если частица имеет такой размер, что может в поры попадать, то соответственно ей доступен больший объем системы, и засчет этого происходит разделение. Считается, что большим молекулам доступен только мертвый объем. Объем занимаемый матриксом, стараются сделать как можно меньше, и чтобы сорбент был как можно более пористым. В пределе, если частица очень мелкая, то она может занимать весь объем хроматографической системы.

Учитывая то, что общий объем составляет 0.385 мертвого объема – соответственно, объем удержания должен находиться в этих пределах, если,конечно, вещество не взаимодействует с матриксом. Но реально даже бромфеноловый синий взаимодействует с матриксом Сефадекса (полисахарид) и выходит за пределы минимального объема удержания. Все фракции должны выходить в пределе не более 4-х мертвых объемов.

V₀ / V_total >= 1-p/3√2 » 0.26 (при гегсагон. упак.)

0.26Vt < VR < Vt ↔ V0 < VR < 3.85 V0

Есть несколько вариантов гель-фиьтрации.

Например, нас интересует не столько разделение, сколько сепарация – отделение низкомолекулярных веществ. Используются сорбенты с оченьузким распределением пор – т.е.сорбенты с примерно одинаковыми порами.

Если нам нужна аналитическая ГФ – можем сделать очень грубую оценку размеров молекулы (корреляция с молекулярным весом?????) Можно использовать калибровку. Нужен сорбент с как можо широким распредлением размеров пор.

Pharmacia:

Sephadex (полисахарид)

G-10 (700 Da)– G-200 (800 KDa)

superfine (10-40мкм) – coarse (100-300мкм)

Sephacryl (Sephadex+BAA)

Sepharose (полисахарид)

6B (4MDa), 4B (20MDa), 2B (40MDa)

Bio-Rad:

Bio-Gel P (PAAG, полисахарид)

(P-2 (2 KDa) – P-300 (400 KDa))

Bio-Gel A (агар) (до 150 MDa)

Полисахарида (агароза) – для широких размеров пор, ППА – низкие. Смешанные – сульфакрил, нити полисахарида сшиты поперечными сшивками.

Только все в шариках.

Микроколоночная хроматография.

По сути не хроматография, а что-то похожее на одноактную экстракцию.

Большое распространение получила в виде наборов

Например очистка невключившегося красителя при секвенировании по Сенгеру

Колонку с сорбентом подвергаем центростремительному ускорению, чтобы из мертвого объема всю жидкость удалить, а чтобы внутри частиц она вся осталась. Наносим на поверхность реакционную смесь; хотим очистить высокомолекулярный компонент и избавиться от низкомолекулярного. Типичный объем сорбента – 700 мкл, наносим 30 мкл смеси. Низкомолекулярный компонент распределятся по всему объему (730), внутри частиц тоже могут попадать, в пределе все 730 мкл, но придется долго ждать, пока наступит равновесие. А высокомолекулярный компонент останентся только в изначальном объеме, если мы полнотью удалили всю жидкость из мертвого объема. Подвергаем ц/ф и получим свои 30 мкл.

Какой коэффициент очистки? Разбавили 30 мкл в 700, и забрали 30. Поэтому коэффициент очистки 30/700, примерно 1/20. Небольшой, причем это еще верхняя граница

И сорбент нужен особый, поверхностное натяжение должно быть такое, чтобы найти центростремитеьное ускорение, чтобы обеспечить условия. Если добавить детергент, то поверхностное натяжение изменится, и метод не работает.

Очистка невысока, 10-20раз. Можно использовать для обессоливания или удаления ЭДТА. А вот если нужно избавиться полностью от чего-то, что даже единичная молекула все испортит, то такой метод не годится.