Электрофорез

Электрофорезом называют перемещение заряженных частиц в электрическом поле (если имеют дело с небольшими ионами, говорят о ионофорезе). Движение вещества происходит в жидкой среде, которая удерживается инертным носителем, например бумагой или полужидким гелем. Жидкость служит проводящей средой для электрического поля, когда к ней приложено внешнее напряжение. Подвижность заряженной частицы (макромолекулы) в электрическом поле называется электрофоретической подвижностью. Зная электрофоретическую подвижность, можно сравнить заряды и массы молекул, входящих в состав исследуемого образца с эталонными белками.

Наибольшее распространение получил электрофорез в полиакриламидном геле, который широко применяется при анализе белков и нуклеиновых кислот.

Значение рI полипептида нельзя вычислять тем же способом, что и для аминокислот. Для нахождения изоэлектрической точки полипептида (белка) необходимо:

1. Измерить подвижность полипептида при нескольких разных значениях рН;

2. Построить график зависимости подвижности от рН;

3. Графически найти значение рН, соответствующее нулевой подвижности.

Значение изоэлектрической точки может дать определённую информацию общего характера об аминокислотном составе белка. Например, белок с большим содержанием кислых аминокислот, чем основных, имеет рI < 7; в противном случае рI > 7/ Пепсин, белок пищеварения, экскретируемый клетками в желудок и очень богатый глутаминовой и аспаргиновой кислотами, имеет рI ~ 1. В то же время гистоны ядра, очень богатые аргинином и лизином, имеют рI ~ 12. Значение изоэлектрической точки может помочь при составлении схемы выделения белка, поскольку растворимость белка минимальна при рН = рI.

Студни и процесс студнеобразования

Студни – это структурированные системы, образующиеся при отвердевании жидких растворов полимеров или при набухании твёрдых полимеров.

[Студни это системы полимер – растворитель, характеризующиеся большими обратимыми деформациями при практически полном отсутствии вязкого течения. Для этих систем иногда применяют термин «гели», который в коллоидной химии означает скоагулированные золи. Исторически термин «гель» появился при исследовании именно полимерной системы (водного раствора желатина), однако, после размежевания коллоидной химии и химии полимеров в последней используют термин «студни».]

Ограниченное набухание полимеров приводит к образованию студней. Примером могут служить такие системы как набухший в органическом растворителе каучук или застывший при охлаждении раствор желатины.

Студни получаются из растворов ВМС, а гели из золей. Студень представляет собой пространственную сетку из макромолекул полимера, заполненную молекулами растворителя. Студень система гомогенная.

Студни могут образовываться не только в результате набухания, но и из твёрдых полимеров, а также из их растворов. Схематически процесс студнеобразования можно представить следующей схемой:

Ограниченное набухание Застудневание

Твёрдые ВМС -----------------→ Студни ←-------------------- Растворы ВМС

Застудневание (желатинирование) – процесс фазового перехода из жидкого состояния в твёрдое состояние. Образование студня происходит в результате взаимодействия между макромолекулами ВМС. Макромолекулы неоднородны и имеют лиофильные (по отношению к воде – гидрофильные) и лиофобные (гидрофобные) участки. У гидрофильных групп макромолекул (-NH₂, -COH, =NH, -OН, -COOH) образуются гидратные слои. Эти слои экранируют отдельные участки макромолекул. Гидрофобные группы (например, -СН₂ – боковых звеньев белков) неспособны формировать подобные слои. Наличие свободных, не защищённых сольватной (гидратной) оболочкой участков макромолекул при определённых условиях, в частности при росте концентрации ВМС, приводит к возникновению взаимодействия между этими участками; в результате образуется структура (каркас, сетка) из макромолекул ВМС, а раствор ВМС переходит в студень. Причины возникновения прочных связей могут быть разными. Например, если полимер содержит ионогенные группы, то взаимодействие этих групп, несущих противоположные по знаку заряды, является одной из причин образования межмолекулярных связей. Полярные группы макромолекул также могут взаимодействовать друг с другом. Иногда возможно образование и водородных связей.

Застудневание (или желатинирование) может происходить самопроизвольно под действием электролитов и при изменении температуры. Так, например, 30 – 34%-й раствор желатина застудневает при 303 К, а 10% -й раствор при более низкой температуре, равной 295К. Повышение концентрации ВМС всегда увеличивает вероятность застудневания, так как при этом возрастает вероятность столкновения макромолекул или их фрагментов. При этом возрастает вероятность образования межмолекулярных связей и, следовательно, появления в системе каркаса. Обычно такой эффект вызывает и понижение температуры, хотя бывают и исключения. Исключения объясняются отрицательным температурным коэффициентом растворимости ВМС.

Электролиты по-разному влияют на скорость застудневания: одни – ускоряют, другие – замедляют, а некоторые – даже исключают возможность перехода ВМС в студень. На застудневание главным образом влияют анионы. Эксперименты показали, что соли серной и уксусной кислот ускоряют процесс застудневания, хлориды и йодиды замедляют, а роданиды приостанавливают этот процесс. Анионы располагаются в следующий ряд по мере уменьшения их действия на процесс застудневания:

SO₄^2- > CH₃COO^1- > Cl^1- > Br^1- > I^1- > CNS^1-

Различия в указанных свойствах электролитов объясняются степенью их гидратации, которая уменьшается у анионов слева направо в данном ряду. Замедляющее действие анионов на процесс застудневания наблюдается, начиная с иона хлора.

На способность к застудневанию водных растворов белков (амфотерные полиэлектролиты) сильно влияет рН среды. Процесс образования студня лучше всего идёт при значении рН, отвечающем изоэлектрической точке, так как при этом по всей длине молекулярной цепи расположено одинаковое число противоположно заряженных ионизированных групп, что способствует установлению связи между отдельными макромолекулами. С изменением рН (в обе стороны от изоэлектрической точки) макромолекулы приобретают одноимённый заряд, что препятствует образованию связей между ними. При добавлении больших количеств кислоты или щёлочи степень ионизации ионогенных групп уменьшается и тенденция к застудневанию снова увеличивается.

Повышение температуры, если только в системе не происходит необратимых химических изменений, обычно препятствуют застудневанию. Это связано с возрастанием интенсивности микроброуновского движения сегментов макромолекул и уменьшением вследствие этого числа связей между макромолекулами. Наоборот, понижение температуры, как правило, способствует застудневанию, так как возрастает число контактов между макромолекулами, связи между ними упрочняются.

На процесс застудневания влияют размеры макромолекул и их разветвлённость. Особенно легко образуют студни ВМС, у которых длина макромолекул достигает нескольких тысяч ангстрем и в тысячи раз превышает их поперечные размеры.

[Ангстрем – внесистемная единица длины, 1А = 10^-10 м = 10^-8 см = 0,1 нм; применяется в оптике, атомной физике, физике твёрдого тела и т.д.]

Застудневанию растворов ВМС всегда способствует повышение концентрации, так как при этом возрастает частота столкновений между макромолекулами или их участками и увеличивается число связей, образующихся в единице объёма студня. Однако, если молекулы полимера вытянуты, то застудневание может проходить и в очень разбавленных растворах. Так, при обычной температуре раствор агара образует студень при его содержании в нём 0,2% сухого вещества.

Чем выше концентрация полимера в растворе, тем выше температура, при которой растворы ВМС переходят в студни. Например, 30 – 45%-ные растворы желатина способны переходить в студни при 30⁰С, 10%-ный раствор переходит в студень при ≈22⁰С. Объём системы при застудневании обычно уменьшается.