Genetics_sivolob_et_al

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

екзон інтрон

Транскрипція, сплайсинг

Рис. 1.9. Мозаїчна будова кодуючої частини гена та схема утворення різних мРНК (ламані лінії – інтрони, що вирізаються) унаслідок альтернативного сплайсингу

Загальна кількість генів у геномах вищих еукаріотів варіює приблизно від 20 до 30 тис. (табл. 1.1). Як показано на рис. 1.10, кодуючі послідовності цих генів займають лише ~1,5 % геному. Решта припадає на міжгенну ДНК (де розташовані також регуляторні ділянки), інтрони (~30 %) і більше ніж половину геному становлять послідовності, що повторюються.

Повтори

Рис. 1.10. Приблизний відносний вміст послідовностей різних типів в еукаріотичному геномі

Основні типи повторів, присутні в геномі вищих еукаріотів:

•гени, представлені кількома (а іноді до 1 тис.) копіями. Часто гени, котрі повторюються, згруповані в кластери, тобто знаходяться поряд один з одним;

21

Генетика

•псевдогени – послідовності, які гомологічні певним генам, але не експресуються. До їхньої появи приводять, наприклад, порушення частини генів, що повторюються: непошкоджені гени беруть на себе функцію пошкоджених, а останні так і залишаються в геномі;

•багатократні повтори коротких послідовностей (тандемні повтори), частина яких розподілена по всьому геному, але більшість зосереджена в теломерних і центромерних зонах хромосом;

•інтерсперсні (дисперговані) мобільні елементи, здатні до переміщення та розмноження в межах геному. Мобільні елементи займають значну частину еукаріотичного геному (від 30 до 50 %), але розподілені в геномі нерівномірно: є довгі ділянки, що на 90 % представлені мобільними елементами, і такі зони, де інтерсперсні елементи відсутні. У цілому спостерігається негативна кореляція між щільністю генів і мобільних елементів. Детальніше

про типи еукаріотичних мобільних елементів йтиметься в розділі 6. Крім клітинного ядра, ДНК є також у мітохондріях і хлоропластах, де являє собою автономний, невеликий порівнянj з ядерним, цито-

плазматичний елемент еукаріотичного геному (див. розділ 6).

СТРУКТУРНА ОРГАНІЗАЦІЯ ДНК У КЛІТИНАХ

Циркулярна ДНК бактеріальної хромосоми існує в клітині у вигляді комплексу з білками. Ця взаємодія є досить динамічною, і практично весь бактеріальний геном (що принципово відрізняє його від еукаріотичного) перебуває в потенційно транскрипційно-активному стані: гени є об'єктами швидкої оперативної регуляції у відповідь на зміну зовнішніх умов.

Загальна довжина ДНК у ядрі еукаріотичної клітини – близько 2 м. Така кількість ДНК вимагає її щільної упаковки, яка зумовлює тотальне пригнічення функціональних активностей у більшій частині геному. Але при цьому упаковка ДНК у клітинному ядрі має дозволяти вибіркову активацію певних ділянок у певні моменти часу. Ці альтернативні завдання вирішуються завдяки тому, що ДНК існує в клітинному ядрі у вигляді складного нуклеопротеїнового комплексу – хроматину. Нуклеопротеїновий комплекс, який містить одну гігантську лінійну молекулу ДНК називають хромосомою.

22

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

Структура хроматину

На першому рівні організації хроматину ДНК формує за рахунок взаємодії з білками елементарні утворення – нуклеосоми. Білковий компонент нуклеосоми (кор) складається з восьми молекул корових гістонів Н2А, Н2В, Н3 і Н4 – по дві молекули кожного типу (див. структуру димеру Н2А-Н2В, який є компонентом кора, на рис. 1.7, а). Октамерний комплекс гістонів має на своїй поверхні своєрідний трек позитивно заряджених амінокислотних залишків, який використовується для взаємодії з нуклеосомною ДНК довжиною 145 пар основ: ДНК утворює на поверхні октамера ~1,7 витка лівої суперспіралі (рис. 1.11).

Н3

Н4

Н2А Н2В

Рис. 1.11. Структура нуклеосоми у двох проекціях. Зображення створено за допомогою програми UCSF Chimera,

код структури у Protein Data Bank 1KX5

У хроматині вся ДНК формує нуклеосоми із середньою щільністю одна нуклеосома на 200 пар основ, сусідні нуклеосоми з'єднані міжнуклеосомними лінкерними ділянками. Нуклеосомна ДНК разом із лінкерною ділянкою становлять так званий нуклеосомний повтор,

23

Генетика

довжина якого варіює як уздовж полінуклеосомного ланцюга, так і залежно від функціонального стану, типу клітин тощо. Характер розподілу нуклеосом уздовж геномної ДНК має важливе функціональне значення: зрозуміло, що лінкерна ДНК є більш доступною для зовнішніх регуляторних впливів.

Як показано на рис. 1.11, кінцеві невпорядковані ділянки гістонів (хвости) виходять за межі нуклеосоми. Завдяки своїй структурній лабільності вони беруть участь в організації хроматину на наднуклеосомному рівні, а також відіграють важливу роль платформи для зв'язування різноманітних білків. Така взаємодія з білками має важливі функціональні наслідки для регуляції генної активності й залежить від посттрансляційних модифікацій хвостів – приєднання певних хімічних груп до певних амінокислотних залишків: ацетилювання, фосфорилювання, метилювання та деяких інших. Співвідношення між характером модифікацій і набором білків, які впізнають певний розподіл модифікованих груп по хвостах, називають гістоновим кодом.

Лінкерні ділянки, якими з'єднані сусідні нуклеосоми, продовжують хід нуклеосомної ДНК по прямій: у результаті нуклеосоми у складі полінуклеосомної нитки розташовані зиґзаґом (рис. 1.12). За рахунок взаємодії з ДНК невпорядкованих хвостів корових гістонів і молекул п'ятого гістона – гістона Н1 (одна молекула на нуклеосому) – полінуклеосомний зиґзаґ конденсується з утворенням так званої фібрили діаметром 30 нм – другого рівня компактизації хроматину.

Гістон Н1

Рис. 1.12. Зиґзаґоподібна конфігурація полінуклеосомної нитки

Фібрила діаметром 30 нм є основною формою хроматину під час інтерфази – періоду між клітинними поділами. Однак у хроматині існує значна гетерогенність за ступенем конденсації. З одного боку, передумовою активації окремих ділянок хроматину є деконденсація

24

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

фібрили. З іншого, – у репресованих ділянках хроматинова фібрила може бути як додатково стабілізованою в компактному стані, так і піддаватися компактизації більш високого порядку. Частина хроматину, що зберігає стан підвищеної компактизації протягом інтерфази, називається гетерохроматином (решта хроматину, де в принципі може відбуватися активація транскрипції, позначається як еухроматин). Утворення гетерохроматину здійснюється головним чином у ділянках, що містять повтори – у центромерах, теломерах та суміжних перицентромерних і субтеломерних ділянках, зонах концентрації мобільних елементів.

На наступному рівні структурної організації у клітинному ядрі хроматинова фібрила формує петлі, кінці яких жорстко закріплені на скелетних білкових структурах клітинного ядра – ядерному матриксі (рис. 1.13). Одна петля, що містить від 20 до 200 тис. пар основ ДНК (один або кілька генів) часто розглядається як важливий елемент регуляції процесів транскрипції та реплікації. Із білками матриксу взаємодіють ділянки ДНК довжиною від 300 до 1 тис. пар основ – ділян-

ки, асоційовані з матриксом (MAR, Matrix Associated Regions).

Петля

хроматинової

фібрили

Рис. 1.13. Схема петельної організації хроматину

Ядерний матрикс – це система білкових філаментів, яка формує структурний каркас ядра. На периферії ядра розташована особлива частина матриксу, асоційована із внутрішньою ядерною мембраною – ядерна ламіна. Від ламіни всередину ядра протягнуті філаменти внутрішнього ядерного матриксу. З ламіною взаємодіє значна частина гетерохроматину, зокрема центромери й теломери хромосом. Еухроматинова частина хромосоми "звисає" всередину ядра, де хроматинові петлі закріплюються на внутрішній частині матриксу. У результаті хромосома займає певну зону в об'ємі ядра – хромосомну територію.

25

Генетика

Хромосоми

У соматичних клітинах переважної більшості багатоклітинних організмів існує подвійний (парний) набір хромосом: гомологічні хромосоми кожної пари містять майже однакові молекули ДНК із майже однаковим набором генів, які розташовані вздовж молекули ДНК в однаковому для двох хромосом порядку (мають певні визначені місця у хромосомі – хромосомні локуси). Таким чином, можна розглядати

ген як певний хромосомний локус. При утворенні статевих клітин

(гамет) до однієї з них переходить по одній хромосомі від пари гомологічних хромосом (див. процес мейозу, описаний нижче) – статева клітина містить одинарний (гаплоїдний) набір хромосом. Відповідно, при заплідненні відбувається об'єднання двох гаплоїдних хромосомних наборів з утворенням диплоїдного набору нащадка. Оскільки дві гомологічні хромосоми походять від різних особин, вони не є абсолютно ідентичними: певні гени можуть бути відсутніми в одній із гомологічних хромосом або мати відмінності у своїх нуклеотидних послідовностях. Різні варіанти одного гена (локусу) називають алелями даного гена.

Слід зауважити, що хромосомні набори багатьох організмів, які розмножуються статевим шляхом, містять одну пару статевих хромосом (усі інші хромосоми називають аутосомами), які представлені двома негомологічними типами. Як правило, одна зі статей є гомогаметною (містить дві статеві хромосоми одного типу), інша – гетерогаметною (різні статеві хромосоми), на чому й базується визначення статі нащадка при заплідненні (див. розділ 6). Слід зазначити також,

що зазвичай під геномом виду розуміють сукупність послідовностей ДНК у гаплоїдному наборі. Саме в цьому розумінні наведено дані щодо розмірів геномів і кількості хромосом у табл. 1.1.

Коли клітина вступає в мітоз, після реплікації ДНК (і, відповідно, подвоєння диплоїдного набору хромосом) починається утворення надкомпактної мітотичної хромосоми, деталі структурної організації якої залишаються недостатньо зрозумілими. Одночасно з компактизацією хроматинової фібрили частина ламіни "розчиняється" разом із ядерною мембраною, інша частина, разом із внутрішнім матриксом, перебудовується з утворенням білкового каркасу мітотичної хромосоми – хромосомного скефолду (scaffold), з яким залишаються зв'язаними основи хроматинових петель. Компактна мітотична хромосома, яка після відповідного забарвлення стає видимою під оптичним мікроскопом, має два плеча (рис. 1.14), розділених центромерною перетяжкою.

26

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

Плече хромосоми

Центромера

Теломера

Рис. 1.14. Схема морфології двох гомологічних мітотичних хромосом

Центромера, що розділяє два плеча хромосоми, є ділянкою хромосоми, на якій відбувається утворення складного мультибілкового комплексу – кінетохору, необхідного для прикріплення мікротрубочок веретена поділу. На перших стадіях мітозу унаслідок реплікації ДНК (див. нижче) кожна хромосома представлена двома сестринськими хроматидами, з'єднаними між собою своїми центромерами за рахунок білок-білкових взаємодій. Пізніше веретено поділу забезпечує розходження дочірніх хромосом (див. обговорення мітозу нижче).

Довжина центромерної ділянки ДНК сильно варіює (від 125 пар основ у дріжджів Saccharomyces cerevisiae до 0,1–4 млн пар основ у людини). У деяких видів, скажімо, у нематоди Caenorhabditis elegans та в річкового рака, окремі хромосоми мають дифузну центромеру – мікротрубочки прикріплюються по всій довжині хромосоми (так звані голоцентричні хромосоми). Найчастіше послідовність ДНК в ділянці центромери представлена тандемними АТ-збагаченими повторами й не містить активних генів. Гомології між центромерними послідовностями різних організмів чи певних консенсусних мотивів, притаманних лише центромерній ДНК, немає: провідну роль у визначенні структури центромери відіграють білки, які взаємодіють із ДНК у цій ділянці. Центромерні білки (одним із головних є, зокрема, CENP A – аналог гістону Н3, який входить до складу нуклеосом у центромерній зоні) забезпечують компактизацію центромерної зони хромосоми та рекрутують до цієї зони білки кінетохору.

27

Генетика

Розміщення центромери на певній хромосомі є постійною характеристикою: під час кожного клітинного поділу локалізація видимої під мікроскопом центромерної перетяжки не змінюється. Залежно від розміщення центромери хромосоми розподіляють на три типи (рис. 1.15):

•метацентричні хромосоми – центромера ділить хромосому на два плеча, приблизно однакових за довжиною;

•субметацентричні хромосоми – центромера ділить хромосому на два плеча, різних за своєю довжиною; плечі позначають латинськими літерами p (коротке плече) і q (довге плече);

•акроцентричні хромосоми – центромера ділить хромосому на два плеча, довжина яких різниться настільки сильно, що під мікроскопом короткі плечі майже не помітні.

Рис. 1.15. Фото трьох типів мітотичних хромосом людини (пар сестринських хроматид, з'єднаних центромерами):

метацентрична (а), субметацентрична (б), акроцентрична (в). Стрілкою позначено центромерну перетяжку

Кожне плече хромосоми закінчується теломерою – комплексом теломерної ДНК на кінці хромосоми та специфічних теломерних білків. Довжина теломерної ділянки варіює в різних організмів (наприклад, у миші понад 30 тис. пар основ, у людини їх 10–15 тис.). Крім того, довжина теломери часто залежить від типу тканини, проліферативної активності клітини тощо.

Розмір хромосом, їхня кількість, відносний розмір плечей – усе це є специфічною видовою характеристикою. Сукупність морфологічних ознак, за якими можна охарактеризувати набір мітотичних хромосом даного організму (виду) називають каріотипом.

Слід зупинитися на особливому випадку, коли окремі хромосоми можна побачити за допомогою оптичного мікроскопа не лише під час мітозу. У деяких клітинах (різноманітні тканини личинок комах,

28

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

клітини трофобласту у ссавців, клітини зародкового міхура в рослин тощо) хромосоми мають гігантські розміри й видимі постійно. Це стає можливим за рахунок того, що хромосома складається не з однієї молекули ДНК, а з декількох сотень і навіть тисяч ідентичних молекул, які накопичуються в результаті багаторазової реплікації без проходження клітиною мітотичних поділів (ендоредуплікація). Такі хромосоми називають політенними. Загалом реплікація без наступного поділу клітини приводить до виникнення багатьох наборів молекул ДНК – поліплоїдизації (див. розділ 4). Але на відміну від поліплоїдних клітин, при політенії однакові копії молекули ДНК контактують між собою по всій довжині, що й дозволяє побачити їх як одну гігантську деконденсовану хромосому.

Політенні хромосоми на цитологічних препаратах мають характерну поперечну посмугованість: темні смуги (диски, або хромомери) чергуються зі світлими (міждисками), створюючи специфічний лише для даної хромосоми малюнок. Вважається, що в області дисків переважно розміщенні гени, активація яких зумовлює характерне здуття диска – появу так званого пуфа. Великий розмір політенних хромосом, можливість досить легкої ідентифікації конкретних геномних ділянок, хромосомних перебудов тощо – усе це робить політенні хромосоми зручним об'єктом дослідження в цитогенетиці. Біологічна роль політенії, можливо, пов'язана з високою метаболічною активністю певних клітин.

РЕПЛІКАЦІЯ ДНК

Комплементарне спарювання нуклеотидів у складі подвійної спіралі ДНК негайно вказує на механізм копіювання генетичної інформації шляхом реплікації. Синтез ДНК відбувається при реплікації з використанням обох полінуклеотидних ланцюгів як матриць – за так званим напівконсервативним механізмом: дві дочірні моле-

кули-копії містять один материнський ланцюг (що служив матрицею) і один ланцюг, синтезований de novo. Включення нуклеотидів до ланцюга, що синтезується, детермінується матрицею за принципом комплементарності. Базові молекулярні механізми реплікації є спільними для всіх організмів.

29

Генетика

Зростання ланцюга ДНК відбувається в напрямку від 5'- до 3'-кінця. Субстратами реакції є 3'-кінцева ОН-група дезоксирибози зростаючого ланцюга та дезоксирибонуклеозидтрифосфати (рис. 1.16). Фермент,

що каталізує цю реакцію, – ДНК-залежна ДНК-полімераза.

фосфат

дезоксирибоза

5'

основа

Рис. 1.16. Схема ДНК-полімеразної реакції

Реплікація ДНК починається з невеликої ділянки – ориджину (origin), де здійснюється ініціація процесу, головним моментом якої є розходження ланцюгів ДНК. Далі з ходом реплікації такий реплікативний міхур (рис. 1.17) розростається у двох протилежних напрямках. На кожному боці міхура існує так звана реплікативна вилка, в основі якої й відбувається синтез ДНК.

Лідируючий

ланцюг

3 '

3 '

5 '

3 ' 5 '

Ланцюг, що запізнюється

– фрагменти Оказакі

Рис. 1.17. Реплікативний міхур – дві реплікативні вилки, які переміщуються у протилежних напрямках

(ланцюги, що синтезуються, показано тільки для однієї з них)

30