Genetics_sivolob_et_al

Розділ 6. Генетика багатоклітинних еукаріотів

У C. elegans є три ключові гени, які контролюють селективну загибель клітин: ced 3, ced 4 і ced 9. Продукти генів ced 3 і ced 4 є індукторами апоптозу, мутації за цими генами зумовлюють повну відсутність елімінації 131 клітини. Продукт гена ced 9, навпаки, є інгібітором апоптозу: інактивація цього гена приводить до елімінації клітин, яка

в нормі не відбувається. Білок Ced-3 є прокаспазою, що міститься

уклітині в неактивній формі. Каспаза Ced-3 активується продуктом гена Ced-4, котрий індукує саморозрізання прокаспази й перетворення її в активу форму. У клітинах, в яких апоптоз не повинен відбуватися, білок Ced-4 блокований білком Ced-9. Апоптичний сигнал приводить до дисоціації Ced-9 від Ced-4 і запуску каспазного каскаду.

сенсор адаптор ефектор

Рис. 6.22. Сигнальниі шляхи розвитку апоптозу у C. elegans і ссавців

Гени, які контролюють апоптоз, досить консервативні. У хребетних знайдені білки, гомологічні таким C. elegans. Зокрема, білок bcl-2, як і його гомолог Ced-9, блокує апоптоз у клітинах ссавців. Обидва білки мають трансмембранний домен і розміщені на зовнішній поверхні мітохондрій, ядра та мембранах ендоплазматичного ретикулуму, що дозволяє їм виступати сенсорами апоптичного сигналу. Білок Apaf-1 (гомолог Ced-4 у ссавців) активує перетворення прокаспази 9 в активну форму і таким чином запускає активаційний каскад протеаз. Білки Ced-4 та Apaf-1 є адапторами апоптичного сигналу, а білкамиефекторами виступають різноманітні каспази (рис. 6.22).

211

Генетика

Контрольні запитання і завдання

1.Опишіть характерні особливості будови та еволюції еукаріотичних геномів.

2.Як класифікують мобільні елементи? За якими механізмами здійс-

нюється їхнє переміщення?

3. Назвіть генетичні наслідки переміщення мобільних елементів

у межах геному?

4.Опишіть процес V(D)J-рекомбінації імуноглобулінових генів.

5.Що таке епігенетичне спадкування та в чому полягають його основні механізми?

6.Що таке ефект положення гена?

7.Які факти підтверджують ендосимбіотичну теорію походження мітохондрій і пластид?

8.Опішить різні типи будови мітохондріальних геномів.

9.Чим зумовлені особливості позаядерного спадкування?

10.Опішить загальну схему визначення статі. Як розрізняють механізми визначення статі за природою стать-детермінуючого сигналу?

11.Як визначається стать за прогамним типом? Епігамним типом?

12.Охарактеризуйте механізми, які зумовлюють детермінацію статі за сингамним типом? Які є різновиди визначення статі за хромосомним типом?

13.Як називається стать, представники якої мають дві ідентичні статеві хромосоми? Дві різні?

14.Опішить механізм визначення статі у дрозофіли. Які особини називаються інтерсексами? Гінандроморфами?

15.Як відбувається детермінація статі у ссавців?

16.Як стать впливає на успадкування ознак? Які ознаки називають зчепленими зі статтю, обмеженими статтю, залежними від статі?

17. Опішить механізми компенсації дози генів статевих хромосом

у дрозофіли та ссавців? Що таке тільце Барра?

18.Що таке тотипотентність?

19.У чому полягає роль цитоплазматичних детермінант на ранніх етапах розвитку зиготи?

20.Як визначаються осі ембріона у дрозофіли?

21.Які групи генів відіграють основну роль у детермінації кількості сегментів тіла дрозофіли та їхньої полярності?

22.Що таке гомеозисні гени? Яку функцію відіграють продукти гомеозисних генів у індивідуальному розвитку дрозофіли? Ссавців?

23.Опішить схему утворення клітин-попередників шести основних клітинних ліній при розвитку C. elegans.

24.Опішить генетичний контроль розвитку вульви в C. еlegans. Які мутації називають гетерохронічними?

25.Як відбувається запрограмована загибель клітин?

212

Генетика

перевірки генотоксичних властивостей хімічних речовин), застосовуючи методи моделювання. Особливості використання даних методик у генетиці людини враховують специфіку людини як генетичного об'єкта.

ЛЮДИНА ЯК ГЕНЕТИЧНИЙ ОБ'ЄКТ

Зрозуміло, що серед усіх живих організмів людина – найбільш цікавий для нас генетичний об'єкт. Але одночасно людину можна вважати найгіршим об'єктом експериментальної генетики: при вирішенні дослідницьких завдань виникають складні обставини методичного та етичного характеру, які зумовлюють проблематичність людини як об'єкта генетичних досліджень. Розглянемо ці труднощі та шляхи подолання їх.

1.Неможливість експериментальних схрещувань у штучних умовах

єцілком зрозумілою, і в першу чергу – з етичних міркувань. Не можна, використавши заздалегідь розроблену схему, відбирати батьків із потрібними генотипами та одержувати й аналізувати їхніх нащадків: люди беруть шлюб вільно, незалежно від генотипу партнера й без будь-якої "дослідницької" мети. Обмеження цієї свободи (шляхом заборони небажаних шлюбів чи сприяння бажаним) було основною ідеєю євгеніки – концепції про "поліпшення" людини біологічним шляхом, в основі якої лежить визнання "генетичних основ" фізичної та психічної нерівноцінності рас, класової нерівності. Спроби такого "поліпшення людської породи" здійснювалися під егідою тоталітарних режимів ХХ століття.

Отже, при генетичному аналізі стосовно людини зникає основа гібридологічного методу – експериментальне схрещування. Існує декілька можливостей для подолання цього "недоліку":

•З великої кількості шлюбних пар генетик може вибрати ті, які його цікавлять, і під час аналізу родоводів зробити висновки стосовно характеру спадкування ознаки.

•Дослідник може проаналізувати спадкування ознак у лабораторних ссавців і зробити попередні висновки щодо можливості спадкування подібних ознак у людини.

•Метод гібридизації соматичних клітин дозволяє в деяких випадках здійснювати генетичний аналіз із використанням культури клітин людини. Аналізуючи гібриди, що утворилися в результаті злиття клітин від двох різних індивідуумів можна робити висновки щодо взаємодії неалельних генів (тест на комплементацію мутацій) і проводити генетичне картування.

214

Розділ 7. Генетика людини

2.Пізня статева зрілість та довга тривалість генерацій – для зміни одного покоління в людини потрібно 20–30 років, що утруднює аналіз спадкування. Головними методичними підходами, які дозволяють вирішити цю проблему, є вивчення великих популяцій людини, реєстрування ознак протягом значного часу (аналіз родоводів), використання методів генетики соматичних клітин ссавців і людини.

3.Невелика кількість нащадків. Проведення статистичного аналізу розщеплення ознак потребує достатньо великої кількості нащадків від однієї пари батьків (див. розділ 3). Людина належить до так званих "малоплідних видів" – за один раз рідко народжується більш ніж одна дитина. Таким чином, проводити аналіз розщеплення ознак на прикладі однієї родини практично неможливо.

Для розв'язання цієї проблеми ведеться пошук багатодітних родин

або відбирається потрібна кількість невеликих сімей, де спостерігається ознака, що цікавить дослідника. Існують великі родоводи, де прояв деяких ознак можна простежити протягом декількох генерацій: у великому родоводі кількість нащадків буде достатньою для аналізу.

4.Відсутність чистих ліній і неможливість їхнього отримання

єіншою об'єктивною причиною, яка утруднює аналіз спадкування ознак. При аналізі спадкування домінантних ознак генетик не завжди може точно визначити генотип батьків, а змушений робити лише більш-менш імовірні припущення.

5.Велика кількість хромосом (груп зчеплення). Хромосомний на-

бір людини складається з 23 пар хромосом і, відповідно, 24 груп зчеплення: 22 аутосоми та дві статеві хромосоми Х і Y. Велика кількість хромосом утруднює їхнє генетичне й цитологічне картування, особливо за допомогою методів класичної генетики. Допомагають розв'язати цю проблему методи гібридизації соматичних клітин людини з соматичними клітинами інших видів ссавців (особливо гризунів) і застосування методів молекулярної цитогенетики, таких як флуоресцентна гібридизація in situ (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH – визна-

чення на хромосомі місця гібридизації комплементарного флуоресцентно міченого ДНК-зонда). Однак, ураховуючи велику кількість генів у людини (приблизно 21 тис.), слід відзначити, що питання картування хромосом людини залишається ще досить далеким від свого вирішення, навіть на тлі повного секвенування геному людини.

6.Неможливість створення стандартних умов існування для різ-

них груп індивідуумів значно утруднює вивчення спадкування багатьох ознак людини, особливо тих, що успадковуються полігенно. Навколишнє середовище має величезний вплив на формування низки

215

Генетика

ознак, однак цей вплив не може змінюватися за бажанням дослідника (харчування, мікроклімат, навчання тощо). Значною проблемою для фахівців при діагностуванні спадкових хвороб є також наявність фенокопій. Цей "недолік" людини як об'єкта генетичних досліджень можна подолати, підбираючи з великої різноманітності людських популяцій групи, схожі за спадковими ознаками і впливом середовища. Для вивчення відносного впливу умов середовища та спадковості на формування ознак використовують близнюковий метод і метод "приймаків" (див. нижче).

До описаних труднощів, з якими стикається генетика людини, слід додати ряд так званих організаційних недоліків, які, на жаль, мають місце в багатьох країнах: незадовільний стан із збереженням документації та реєстрацією смертності, діагностикою і статистикою захворювань.

Незважаючи на перераховані проблеми, людина як генетичний об'єкт має також ряд важливих переваг: існує великий масив даних щодо нормальної та патологічної анатомії, фізіології та біохімії людини; існує можливість спілкування з об'єктом дослідження, що полегшує отримання інформації про його родичів і допомагає досліджувати ознаки, пов'язані з відчуттями, емоціями, інтелектом; практично повністю встановлено геном людини.

ГЕНОМ ЛЮДИНИ

Проект розшифрування геному людини (Human Genome Project) був одним із найамбітніших наукових проектів ХХ століття. Він тривав 13 років і закінчився у 2003 р. Проект мав на меті побудувати достатньо точну генетичну карту (з кроком 2–5 сМ), отримати послідовність 3 млрд пар основ ДНК, ідентифікувати генні послідовності, визначити геномні варіації. У результаті виконання проекту побудована генетична карта з кроком у 1 сМ, отримані послідовності 99,9 % еухроматинових ділянок геному з точністю 99,99 %, отримано 15 тис. повних кДНК (змістовних послідовностей білкових генів, див. розділ 9) та ідентифіковано близько 3 млн нуклеотидів, що варіюють у геномах людини (SNP – single nucleotide polymorphism).

Традиційно геном людини представляють як сукупність послідовностей ДНК 22 аутосом і двох статевих хромосом X та Y. Незважаючи на великий розмір геному (приблизно 3,2 млрд пар основ), верхня оцінка кількості білкових генів у геномі людини не перевищує 25 тис.

216

Розділ 7. Генетика людини

(ідентифікація всіх генів РНК є досить далекою від остаточного завершення). Останні версії каталогу білкових генів людини включають близько 21 тис. білкових генів і 4 тис. генів РНК (остання оцінка є напевно заниженою). Загальна довжина кодуючих ділянок генів дорівнює приблизно 34 млн пар основ, тобто становить 1,2 % геному. Складнішим є визначення зв'язку між генним локусом, продуктом і фенотипом, який він може зумовлювати. На 15 жовтня 2008 р. база даних OMIM містила тільки 12 тис. 514 генів, для яких відомі фенотипові прояви.

Щодо мітохондріальної ДНК людини, геном мітохондрій представлений кільцевою молекулою ДНК розміром 16 тис. 569 пар основ і містить 37 генів: гени білків, які беруть участь в окисному фосфорилюванні, 2 гени рРНК і 22 гени тРНК.

Ядерна геномна ДНК людини, як у інших еукаріотів, організована у хромосоми (див. розділ 1). Нормальний хромосомний набір людини складається із 46 хромосом: 22 пар аутосом і пари статевих хромосом (XX у жінок та XY у чоловіків). Рівномірно пофарбовані метафазні хромосоми людини за розміром і морфологією поділяються на сім груп (позначаються латинськими літерами від A до G, рис. 7.1).

Рис. 7.1. Рівномірно пофарбовані метафазні хромосоми людини: (а) – метафазна пластинка; (б) – розкладка хромосом по групах (A-G);

окремі хромосоми в межах груп, як правило, неможливо дискримінувати за такого способу фарбування (за винятком хромосом 1, 2, 3, 16 і Y)

217

Генетика

Для більш точної ідентифікації хромосом та їхніх специфічних ділянок застосовують спеціальні методи диференційного забарвлення хромосом, які базуються на використанні певних барвників і процедур попередньої обробки препаратів (рис. 7.2). Найпоширенішим методом диференційного пофарбування є метод G-забарвлення, який дозволяє отримати хромосоми, нерівномірно пофарбовані по довжині. Малюнок чергування темних і світлих смуг є унікальним для кожної пари гомологічних хромосом. Цікаво, що темні та світлі смуги асоційовані з ділянками, збагаченими на AT- і GC-пари відповідно (тобто, відповідно, з геномними зонами, збагаченими на мобільні елементи та кодуючі послідовності). Практично таку саму картину чергування смуг дає метод Q-забарвлення (базується на використанні флуоресцентних барвників). Малюнок сегментів при R-забарвленні є протилежним до такого, що спостерігається при G- і Q-забарвленнях: R-позитивні смуги відповідають GC-збагаченим ділянкам геному. Існують також методи диференційного забарвлення, що дозволяють, наприклад, виявляти центромери та перицентромерний гетерохроматин (С-забарвлення) або ядерцеві організатори – місця локалізації кластерів генів рРНК – (ЯОР-забарвлення), які знаходяться у людини в ділянках вторинної перетяжки коротких плечей акроцентричних хромосом (хромосоми 13–15, 21 і 22).

Рис. 7.2. Диференційне забарвлення хромосом людини: Q-забарвлення (а); G-забарвлення (б); R-забарвлення (в); С-забарвлення (г); ЯОР-забарвлення (д),

ядерцевий організатор вказано стрілкою

Результати аналізу геному людини свідчать про надзвичайно високу подібність послідовностей ДНК у різних індивідуумів: відповідно останнім оцінкам, будь-які дві людини є ідентичними за нуклеотидними послідовностями на 99,5 %, тобто вся сукупність різноманітних фенотипів у людини зумовлюється варіаціями тільки 0,5 % геному.

218

Розділ 7. Генетика людини

Першими, ще задовго до появи методів секвенування ДНК (установлення послідовності, див. розділ 9), були описані варіанти геному людини, які характеризуються зміною кількості й структури хромосом. Анеуплоїдії та хромосомні перебудови часто асоційовані з різними захворюваннями, але гетероморфізм гомологічних хромосом (наявність у них сегментів, які відрізняються за розміром, морфологією або особливостями забарвлення) не обов'язково пов'язаний з патологічними змінами фенотипу й достатньо часто зустрічається в людській популяції (хромосомний поліморфізм). Такі великі геномні зміни, що торкаються послідовностей ДНК розміром понад 3 млн пар основ, визначають як мікроскопічні структурні варіанти.

У процесі аналізу нуклеотидних послідовностей людини були виявлені численні "дрібномасштабні" варіанти геномних послідовностей, розмір яких не перевищує 1 тис. пар основ. Приблизно 80 % таких ДНК-варіантів представлено у вигляді поодиноких нуклеотидних замін (SNP). За приблизними оцінками в людській популяції одна нуклеотидна заміна зустрічається на кожні 300 нуклеотидних пар. Крім SNP до "дрібномасштабних" варіантів геному відносять невеликі делеції, дуплікації та інверсії (див. рис. 4.1), варіації кількості мікрота мінісателітних повторів. SNP і дрібні перебудови спостерігаються також у мітохондріальному геномі.

В останні три-чотири роки були розроблені нові підходи ефективного аналізу структури геному, які дозволили виявити варіації нуклеотидних послідовностей, що мають проміжну довжину між 1 тис. та 3 млн пар основ. Такі геномні варіанти отримали назву субмікроскопічних структурних варіантів. Субмікроскопічні структурні варіанти в основному представлені інверсіями та CNVs (Copy-Number Variants) – варіантами за кількістю копій елементів послідовності порівняно з "еталонним геномом". Нині описано декілька сотень субмікроскопічних структурних варіантів.

При дослідженні індивідуальних геномних варіацій основну увагу приділяють SNP та іншим "дрібномасштабним" геномним варіаціям. Вважається, що саме вони зумовлюють різноманітність фенотипових варіантів, а також можуть бути відповідальними за схильність до деяких хвороб за дії несприятливих факторів середовища. Очевидно, що більша частина "дрібномасштабних" варіацій спостерігається в некодуючих ділянках геному (яких просто значно більше), і такі варіації не впливають на структуру білків. Тому аналіз в основному зосереджують на екзонних варіантах, особливо на несинонімічних нуклеотидних замі-

219

Генетика

нах. Проте, накопичуються дані про роль синонімічних замін і замін у некодуючих ділянках у деяких фенотипових проявах (див. розділ 4).

Крім установлення зв'язку поліморфізм – фенотип, "дрібномасштабні" варіації геному використовуються для потреб медичної генетики (при виявлені носіїв рецесивних мутантних генів), популяційної генетики людини (визначення спорідненості між популяціями людей) і судо- во-медичної експертизи при встановлені особистості або батьківства (у цьому випадку широко використовують поліморфізм за мініта мікросателітними локусами). Мініта мікросателіти є гіперваріабельними тандемними повторами. Їхня різноманітність настільки висока, що кожна людина (крім монозиготних близнюків) має індивідуальний набір варіантів даних послідовностей. За цими наборами одну людину можна відрізнити від іншої так само легко, як і за відбитками пальців, тому методика ідентифікації особистості за мініта мікросателітними повторами отримала назву ДНК-фінгерпринтингу (див. розділ 9).

Інформація про геном людини, особливо про індивідуальні структурні варіанти геному, розширила наше уявлення про зв'язок генотип – фенотип. Швидкий розвиток методів секвенування ДНК дозволяє говорити про "генетичну паспортизацію" (установлення повних послідовностей геномів кожної людини) як про досить близьку перспективу.

ВИЗНАЧЕННЯ ТИПІВ СПАДКУВАННЯ В ЛЮДИНИ. СКЛАДАННЯ РОДОВОДІВ

Поряд із методами молекулярної генетики, не втратили свого значення традиційні підходи генетичного аналізу людини. Генетичний аналіз будь-якої ознаки в першу чергу має починатися із з'ясування питання, чи успадковується ознака, що нас цікавить. Якщо ознака є спадковою, то другим питанням буде тип її спадкування. Майже універсальним методом, який дозволяє отримати відповіді на дані запитання при дослідженні спадкування ознак людини, був і залишається метод складання та аналізу родоводів. При їхньому складанні ведуться детальні записи про кожного із членів родини та ступінь спорідненості між ними. Далі інформація про родину відображається у графічному вигляді: за допомогою спеціальної символіки (рис. 7.3) будується генеалогічне дерево (педігрі).

220