Genetics_sivolob_et_al

Розділ 5. Генетика бактерій, вірусів і одноклітинних еукаріотів

штаму не розмножуються на середовищі без триптофану, а іншого – потребують гістидин, то на відповідному середовищі можна відібрати "гібридні" диплоїдні колонії.

Рис. 5.10. Життєвий цикл аскоміцета Saccharomyces cerevisiae

Якщо ізолювати окрему аскоспору, то її потомство, яке виникне за рахунок брунькування, має складатися з клітин одного типу. Проте такий штам не буде насправді моноспоровим, якщо в нього присутній ген НО, який забезпечує перемикання типів клітин: клітина а утворює бруньку типу α (або навпаки). Звичайно, у цьому випадку клітини різного типу, що накопичуються, будуть спарюватися з утворенням диплоїдних гетерозигот, які врешті-решт і будуть переважати в культурі.

Перемикання типів клітин у S. cerevisiae є прикладом програмованої геномної перебудови. Локус МАТ розташований у правому плечі третьої хромосоми: елемент послідовності Yа або Yα, який визначає алельну форму локусу, фланкований кількома іншими елементами з обох боків (рис. 5.11, де зображено конфігурацію, що відповідає алелю МАТα). Поблизу від лівої та правої теломер є дві так звані касети, що являють собою алелі α та а відповідно. Але касети (позначаються як HMLα та HMLа) знаходяться у субтеломерних гетерохроматинових зонах, і тому не експресуються – вони недоступні для системи транскрипції внаслідок додаткової компактизації хроматину (див. розділ 6).

161

Генетика

При перемиканні типів клітин спрацьовує ген НО, який кодує специфічну нуклеазу. Нуклеаза НО розрізає локус МАТ у зоні елемента Yα (або Yа). Наступні події еквівалентні схемі гомологічної рекомбінації (порівн. рис. 5.11 і 1.25): дволанцюговий розріз розширюється з утворенням двох 3'-кінцевих одноланцюгових хвостів, у хромосомі утворюється петля й гомологічна касета HMLа підводиться до зони розрізу, відбувається репараційний синтез ДНК на ланцюгах ДНК касети. Результатом є конверсія гена: заміна локусу МАТα на локус МАТа. Обидві касети при цьому залишаються в незмінному вигляді, і в майбутніх поколіннях ліва касета може бути використана для зворотного перемикання локусу МАТа на МАТα.

MATa

Рис. 5.11. Схема перемикання типу спарювання у S. cerevisiae.

Якщо в центрі міститься локус МАТа, для конверсії використовується касета HMLα

Результатом синтезу ДНК, що зображено на вставці рис. 5.11, буде утворення двох структур Холідея (порівн. рис. 1.26). Як пояснювалось у розділі 1, є два рівноймовірні шляхи розділення цих структур: із кросинговером між двома дуплексами та без (див. також рис. 1.28). У випадку, зображеному на рис. 5.11, кросинговер між двома дуплексами, що належать одній хромосомі, зумовить делецію – вирізання ділянки між локусом МАТ і касетою HMLа. Отже, у цьому разі спрямо-

162

Розділ 5. Генетика бактерій, вірусів і одноклітинних еукаріотів

вано реалізуються лише такі варіанти розділення, які не приводять до кросинговеру та, відповідно, хромосомних аберацій.

Слід зауважити, що й при міжхроматидній гомологічній рекомбінації не завжди кросинговер і конверсія без кросинговеру є рівноймовірними подіями. Так, при рекомбінації під час мітозу диплоїдних клітин дріжджів кросинговер відбувається лише в 10 % рекомбінаційних подій. Таким чином, принаймні в деяких випадках, процеси гомологічної рекомбінації можуть здійснюватися саме з метою конверсії геномної ділянки, яка б не супроводжувалась кросинговером.

Касетний механізм перемикання активності генів є досить поширеним: аналогічні процеси описано для інших видів аскоміцетів, трипаносом і деяких бактерій. Крім того, такий механізм напевно реалізується при внутрішньохромосомній гомологічній рекомбінації на генах, що тандемно повторюються (за принципом, який ілюструє рис. 5.11, і без кросинговеру), з метою підтримувати ідентичність тандемних копій: мутація в одній з таких копій з високою імовірністю буде елімінована за рахунок використання іншої з багатьох нормальних гомологічних ділянок як матриці.

Повернемося до перемикання типів клітин у S. сerevisiae, яке є також добре вивченим прикладом взаємодії генів на рівні регуляції транскрипції. Приблизно по центру локусу МАТα розташована операторна ділянка, що активує два промотори, з яких відбувається транскрипція у двох протилежних напрямках. Продуктами цих генів є два білки α1 та α2 – транскрипційні фактори. Перший із них активує транскрипцію групи генів, які визначають специфічні ознаки клітин α-типу, другий – є репресором для групи а-специфічних генів (рис. 5.12). При цьому в гаплоїдних клітинах обох типів експресується група генів, специфічних для гаплоїдних клітин узагалі – за рахунок активації іншим фактором транскрипції. У клітинах а-типу з локусу МАТа експресується білок а1, який сам по собі не впливає на транскрипцію зазначених груп генів, але відсутність білків α1 і α2 зумовлює активацію а-специфічних (за відсутності репресора) і вимикання α-специфічних (за відсутності активатора) генів (рис. 5.12). У гетерозиготних за обома МАТ-локусами диплоїдних клітинах білок а1 утворює комплекс із α2, який ефективно блокує транскрипцію α1 (у результаті α-специфічні гени знову вимкнено), а також транскрипцію генів, специфічних для гаплоїдних клітин (рис. 5.12).

Крім того, комплекс а1-α2 є репресором гена НО, який не здатен ініціювати процес рекомбінації, зображений на рис. 5.11, у диплоїдних клітинах. Активація цього гена в гаплоїдних клітинах потребує набору певних активаторів транскрипції, поява яких узгоджена з регуляцією клітинного циклу: вони з'являються тільки на пізній G1-стадії, коли й може розпочатися перемикання типів клітин.

163

Генетика

Диплоїдні клітини

Рис. 5.12. Схема регуляції транскрипції в диплоїдних і гаплоїдних клітинах двох типів S. cerevisiae. Червоні стрілки – мРНК, овали –

відповідні білкові продукти, які є факторами транскрипції груп генів, котрі специфічно виявляються в гаплоїдних клітинах узагалі (hsg), а-клітинах (asg) та α-клітинах (αsg)

Але регуляція активності гена НО є ще складнішою та не до кінця з'ясованою. Справа в тому, що після мітозу гаплоїдна спора продукує два типи клітин, які дещо розрізняються за властивостями, – так звані материнську та дочірню. Перемикання типів клітин відбувається тільки в материнській клітині, дочірня не здатна це робити, оскільки ген НО не активується. Отже, материнська клітина змінює свій тип – наприклад, а на α, і відбувається поділ з утворенням двох α-клітин, одна з яких знову є материнською і змінює свій тип на а, а інша – дочірньою, вона залишається клітиною α-типу.

Така асиметрія продуктів мітозу є характерною також для диференціації клітин багатоклітинних організмів, коли стовбурова клітина дає початок стовбуровій клітині та клітині, котра є більш спеціалізованою та такою, що втратила частину потенціалу розвитку. Розглянуті приклади відображають лише невелику частину вивчених для S. cerevisiae генетичних механізмів, які допомагають з'ясувати загальні закономірності функціонування еукаріотичного апарату спадковості.

164

Розділ 5. Генетика бактерій, вірусів і одноклітинних еукаріотів

Інфузорія

Генетичний апарат інфузорій відрізняється унікальною особливістю: у клітині присутні не одне, а два ядра – мікрота макронуклеус. Перший із них містить диплоїдний набір хромосом (наприклад, у Tetrahymena thermophila п'ять пар хромосом), які є тільки сховищем спадкової інформації – гени мікронуклеуса не експресуються. У макронуклеусі хромосомний набір є багатократно дуплікованим (кілька сотень хромосом), і саме гени макронуклеуса активно експресуються, але при цьому не передаються нащадкам.

При нестатевому розмноженні поділ мікронуклеуса здійснюється шляхом мітозу, а макронуклеуса – шляхом простого поділу, тобто з часом він старіє, і його активність знижується. Тоді між двома клітинами проходить статевий процес: відбувається кон'югація, під час якої макронуклеуси руйнуються, мікронуклеуси розділяються шляхом мейозу, і клітини обмінюються гаплоїдними ядрами – деталі процесу можуть розрізнятися для різних видів, але в результаті утворюються клітини, що мають по одному диплоїдному мікронуклеусу. Негайно після цього здійснюється його мітотичний поділ, і одне з дочірніх ядер перетворюється на макронуклеус.

Під час формування макронуклеуса геном не тільки багатократно дуплікується, а й піддається суттєвим перебудовам. Спочатку в складі ядра-попередника макронуклеуса проходять багатократні раунди реплікації ДНК – політенізація хромосом. Далі видаляються численні елементи послідовності ДНК (IES – internal eliminated sequences), роз-

ташовані всередині генів мікронуклеуса (таким чином, гени мікронуклеуса, що перериваються IES, у принципі не можуть бути експресованими). Після стикування кодуючих послідовностей генів здійснюється фрагментація хромосом на своєрідні мікрохромосоми – кожна має один або кілька генів і теломери на кінцях, які синтезуються теломеразою. Під час фрагментації хромосом видаляються також усі міжгенні зони, послідовності, що повторюються, і мобільні елементи – прибирається все беззмістовне "сміття". Загалом видаляється до 90 % геному. Нарешті, мікрохромосоми ампліфікуються в 4–6 раундах реплікації – процес дозрівання макронуклеуса завершується.

Геном макронуклеуса інфузорії Tetrahymena thermophila вже встановлено. Він містить 27 тис. генів – стільки ж, скільки у вищих еукаріотів (навіть трохи більше, ніж у людини). Унаслідок видалення значної частини ДНК загальний розмір геному (гаплоїдного набору) дорівнює 105 млн пар основ (у 30 разів менше, ніж у ссавців), вміст послідовностей, що повторюються становить ~2 %. Цікавою особливістю генетично-

165

Генетика

го апарату Tetrahymena є те, що кодони UAA та UAG (стоп-кодони для більшості організмів) кодують амінокислоту глутамін: тільки UGA використовується як стоп-кодон.

Незвичайна система функціонування спадкового апарату інфузорій ставить важливе фундаментальне питання: чому в еукаріотичних геномах зберігається велика кількість беззмістовної ДНК? При тому, що загальна структура геному інфузорії практично не відрізняється від такої вищих еукаріотів, реалізується механізм видалення беззмістовних послідовностей при утворенні макронуклеуса. Отже, ці послідовності не потрібні для експресії генетичної інформації. Проте ці "зайві" послідовності, як і в інших еукаріотів, ретельно зберігаються в мікронуклеусі й передаються нащадкам. У чому може полягати адаптивне значення такого збереження, залишається не зовсім зрозумілим. Утім, принаймні одна відповідь на це питання здається очевидною: беззмістовна ДНК є саме тією "обкладинкою", в якій зберігається змістовна ДНК, або своєрідним буфером, що захищає змістовний генетичний матеріал від пошкоджуючих впливів. Адже зовнішні мутагенні фактори імовірніше спрямовані на беззмістовну ДНК через те, що вона становить переважну більшість еукаріотичного геному.

Контрольні запитання і завдання

1.Яка різниця між бактеріальними штамами типів F+ і Hfr?

2.Якими шляхами здійснюється перенесення генетичного матеріалу між бактеріями?

3.На які класи можна поділити бактеріофаги за типом носія генетичної інформації?

4.Поясніть різницю між сайт-специфічною та гомологічною рекомбінацією. Яке функціональне значення має сайт-специфічна рекомбінація?

5.Опишіть життєвий цикл бактеріофага λ. Від чого залежить вибір шляхів розвитку цього фага?

6.Яку функцію виконує репресор фага λ? У чому полягає механізм його дії?

7.На які класи та за яким принципом поділяють еукаріотичні віруси?

8.Опишіть цикл розвитку ретровірусів.

9.Як відбувається розмноження Saccharomyces cerevisiae?

10.За яким механізмом здійснюється перемикання типів спарювання в S. cerevisiae?

11.У чому полягає структурна та функціональна різниця між макрота мікронуклеусом у інфузорій?

166

РОЗДІЛ 6

Генетика багатоклітинних еукаріотів

Найхарактернішими особливостями організації спадкового апарату еукаріотів порівняно з прокаріотами є (див. також розділи 1 і 2):

•Наявність клітинного ядра з кількома молекулами ДНК, які є компонентами складних білково-нуклеїнових комплексів – хромосом.

•Присутність, поряд із головним ядерним спадковим апаратом, цитоплазматичних елементів спадковості – ДНК усередині мітохондрій і хлоропластів.

•Великий розмір еукаріотичних геномів, причому значна частка припадає на послідовності ДНК, які повторюються багато разів.

•Мозаїчний принцип будови еукаріотичних генів, причому один ген може давати кілька різних функціональних продуктів за рахунок альтернативного сплайсингу.

•Велика кількість генів, причому всі клітини багатоклітинного організму (за винятком деяких) містять ідентичні набори генів, хоча більша їхня частка є неактивною у клітинах даного типу. Це викликає необхідність реалізації складної системи регуляції експресії генів у процесі диференціювання клітин під час онтогенезу. Одним із важливих елементів цієї системи є епігенетична спадковість – забезпечення спадкування дочірніми клітинами не просто набору генів, а й системи специфічного блокування певної їхньої частини.

•Статевий процес, що лежить в основі розмноження переважної більшості багатоклітинних організмів: нащадок отримує два набори алельних генів від двох батьків різної статі. Механізми

визначення статі є важливим розділом генетики еукаріотів. Базуючись на матеріалі попередніх розділів, розглянемо ці особли-

вості детальніше.

Генетика

ЕУКАРІОТИЧНІ ГЕНОМИ

Загальні риси будови еукаріотичних геномів

Усі гени багатоклітинного організму можна розділити на дві групи: 1) гени, від яких залежать певні універсальні функції, і які є активними в усіх клітинах, – "гени домашнього господарства" (housekeeping genes); 2) гени, що специфічно активуються в клітинах певного типу, – "гени розкоші" (luxury genes). Досить загальною ознакою генів першої групи є розташування в їхніх регуляторних зонах так званих CpG-острівців – ділянок із підвищеним вмістом динуклеотидів CpG (мається на увазі послідовність нуклеотидів уздовж подвійної спіралі). Загалом вміст цих динуклетидів у еукаріотичних геномах приблизно у п'ять разів менший за очікуваний унаслідок метилювання цитозину в складі CpG-контакту: 5mC (5-метилцитозин) спонтанно перетворюється на тимін, що є одним із джерел виникнення мутацій. Метилування цитозину в регуляторних ділянках є одним із механізмів репресії генів (див. нижче). Відповідно, гени, які зберігають свою активність у більшості клітин, містять неметильовані динуклеотиди CpG, вміст яких зберігається на високому рівні.

Загальна кількість білкових генів у геномах вищих еукаріотів варіює приблизно від 20 до 30 тис. (див. табл. 1.1). Приблизний розподіл еукаріотичних білків за їхніми функціями показано на рис. 6.1.

Сигнальна

трансдукція

Рис. 6.1. Приблизний розподіл білків еукаріотичного протеому за функціями

168

Розділ 6. Генетика багатоклітинних еукаріотів

Серед еукаріотичних генів 25–50 % є унікальними (представлені в геномі єдиною копією), решта належать до родин генів, що складаються з кількох копій, як правило, не ідентичних. Відповідні (гомологічні але не ідентичні) білки становлять родину білків. Кілька родин (протеїнкінази, транскрипційні фактори певного типу, імуноглобуліни) містять сотні білків, більшість родин складається з кількох (до 30) білків. Гени такої родини часто об'єднані в геномі в кластери – знаходяться поряд у певній хромосомі (кластери генів теплового шоку, глобінові гени). Слід зауважити, що такий кластер не є опероном – кожен ген піддається регуляції як окрема одиниця транскрипції. Наприклад, кластер генів β-субодиниці гемоглобіну містить гомологічні гени, які активуються на певних стадіях індивідуального розвитку (рис. 6.2). Проте всі гени кластеру мають також спільну регуляторну зону, яка відповідає за загальний потенційно активний стан кластеру в клітинах, які в принципі мають здійснювати синтез гемоглобіну.

~60 000 пар основ

Рис. 6.2. Кластер β-глобіну в 16 хромосомі людини (кожен ген містить інтрони). Указано стадії розвитку, на яких відповідні гени є активними

β-Глобіновий кластер містить також неактивний псевдоген (див. розділ 1). Після дезактивації гена (порушення внаслідок мутації ініціації транскрипції, сплайсингу тощо) псевдоген перестає бути об'- єктом відбору, і в ньому накопичується велика кількість мутацій. Зрозуміло, що в першу чергу псевдогени з'являються саме в кластерах – коли є кілька копій гена, і пошкодження одного з них не приводить до фатальних наслідків.

Кілька генних кластерів повторюються в геномі багато разів. Серед білкових генів це стосується генів гістонів (див. розділ 1) – гени п'яти молекул гістонів завжди згруповані в кластер (кожен ген – окрема одиниця транскрипції), який повторюється до 100 разів. Іншим прикладом кластерів, що повторюються, є гени рибосомної РНК (див. розділ 2), але в цьому випадку кластер є одиницею транскрипції.

Крім генів, що повторюються, еукаріотичний геном містить значну кількість інших послідовностей, що повторюються (до 50 % геному). Основні типи таких повторів, крім уже згаданих псевдогенів, такі:

169

Генетика

1. Тандемні повтори. До таких відносять багатократні повтори коротких послідовностей по 6–8 пар основ у теломерах і повтори так званої α-сателітної ДНК у центромерах (довжина повтору варіює від 7 пар основ у дрозофіли до 100–200 пар основ у ссавців, у людини – 171 пара основ). По всьому геному розподілені також так звані прості повтори (SSR, simple sequence repeats). Зазвичай виділяють мікроса-

теліти – 1–15 пар основ, що повторюються від 10 до кількох тисяч разів, і мінісателіти – 15–500 пар основ, що повторюються до 100 разів. Кількість мініта мікросателітних локусів становить десятки й сотні тисяч. Розподіл локусів за кількістю повторів є специфічною індивідуальною ознакою – на кшталт відбитків пальців.

2. Сегментні дуплікації – великі блоки довжиною 1–200 тис. пар основ, які характеризуються високим ступенем гомології. Імовірно, сегментні дуплікації є продуктом колишніх порушень хромосом. Частіше зустрічаються в перицентромерних і субтеломерних зонах.

3. Інтерсперсні (мобільні) елементи, здатні до переміщення та розмноження в межах геному, становлять основну кількість ДНК, що повторюється. Частина таких послідовностей є результатом колишньої активності мобільних елементів (таких, що втратили здатність до переміщення). Основні типи еукаріотичних мобільних елементів:

•ДНК-транспозони – переміщення здійснюється шляхом вирізання ділянки ДНК із наступним вбудовуванням її в інше місце – цілком аналогічно до відповідних елементів у прокаріотів. Транспозони містять один або два гени (у різних видів), що кодують транспозазу – фермент, який забезпечує транспозицію елемента, – його вирізання з донорного сайта та вбудовування в сайт-мішень. Гени транспозази можуть бути пошкодженими – тоді транспозиція даного елемента відбувається з використанням транспозази, закодованої іншим ДНК-транспозоном.

Кодуюча частина транспозона фланкована невеликими інвертованими повторами, які впізнає транспозаза, вирізаючи фрагмент ДНК. Сайт-мішень – невелика специфічна послідовність ДНК, котра теж упізнається транспозазою і теж розрізається, після чого транспозаза каталізує вбудовування транспозона до сайта-мішені (рис. 6.3). Процес транспозиції залишає дволанцюговий розріз у місці, де містився транспозон. У разі незалежної від реплікації транспозиції (нереплікативна транспозиція), цей розріз піддається репарації за механізмом негомологічного з'єднання кінців (див. розділ 1). Тобто транспозон просто "стрибає" в інше місце. Але досить часто транспозиція

170