Genetics_sivolob_et_al

Розділ 6. Генетика багатоклітинних еукаріотів

Природу межі, яка відділяє гетерохроматин у центромерній зоні, не з'ясовано, але гранична ділянка містить свій специфічний маркер – метильований Lys4 гістона Н3 (і деметильований Lys9).

Me-Lys9

Рис. 6.9. Розповсюдження та самопідтримання гетерохроматинового стану в центромерах

У процесі реплікації, що здійснюється нерівномірно в різних ділянках (гетерохроматин реплікується в останню чергу), білки тимчасово знімаються з ДНК у реплікативній вилці (розділ 1). За точкою реплікації гістони батьківського хроматину (котрі несуть на собі гетерохроматинові маркери) повертаються на дочірні молекули ДНК разом із гістонами, синтезованими de novo. НР1 також повертається на той самий локус, де він був присутній, і відновлює патерни модифікацій нових гістонів та компактний (репресований) стан гетерохроматинової ділянки. Тобто гетерохроматиновий стан даного локусу відтворюється в дочірніх клітинах. При цьому НР1 має спорідненість до білків ламіни (розділ 1), що зумовлює розташування гетерохроматину в периферичних зонах клітинного ядра.

Подібна система репресії за участю НР1 широко використовується в інших ділянках гетерохроматину, а також для гарантованого блокування генів в еухроматинових зонах. Метилювання Lys9 гістона Н3 і деацетильований стан лізинів гістонів Н3/Н4 є найхарактернішою ознакою таких ділянок. Обидві модифікації, як описано вище, самопідримуються та підтримують одна одну через опосередковану дію НР1. При цьому важливу роль у забезпеченні репресованого стану відіграє метилювання цитозинів ДНК – інша ковалентна модифікація, яка також відновлюється при клітинному поділі й замикає своєрідне "коло репресії" (рис. 6.10).

181

Генетика

Рис. 6.10. Взаємний вплив деацетилювання гістонів, метилювання Lys9 гістона Н3 і метилювання ДНК у гетерохроматині. Lys+ – деацетильовані лізини

Метилювання ДНК

Патерн тканиноспецифічного метилювання ДНК (утворення 5mC у складі динуклеотидів CpG, рис. 6.11) є результатом двох процесів: підтримання метильованого статусу після реплікації та метилювання de novo.

Рис. 6.11. Динуклеотид CpG у ДНК – субстрат метилювання

Підтримуюча ДНК-метилтрансфераза спрацьовує протягом 1–2 хв після реплікації: дві дочірні молекули ДНК містять батьківский ланцюг ДНК (із 5mС у складі CpG) і синтезований ланцюг, де цитозин не є метильованим. Метилтрансфераза впізнає такі напівметильовані динуклеотидні контакти й відновлює симетрію щодо метилювання С. За рахунок цього процесу патерн метилювання відтворюється в дочірніх клітинах, що є, поряд із відновленням модифікацій гістонів, одним із важливих механізмів епігенетичного спадкування.

Інші ДНК-метилтрансферази здійснюють метилювання ДНК de novo. Особливо важливим цей процес є на ранніх стадіях ембріонального розвитку, коли ДНК тотально деметильована. У процесі розвитку здійснюється метилювання, яке визначає специфічне вимикання певних

182

Розділ 6. Генетика багатоклітинних еукаріотів

груп генів при диференціюванні клітин. Крім того, деметилювання є можливим і в диференційованих клітинах, де метилтрансферази використовуються для відновлення метильованого статусу.

Залучення 5mС до репресії пов'язане з наявністю у складі певних білків особливих структурних модулів – MBD (Methyl Binding Domain), які мають специфічну спорідненість до метильованих динуклеотидів CpG. Білки, що містять MBD, є компонентами різноманітних репресуючих комплексів. Зокрема, такі білки рекрутують до метильованих ділянок хроматину гістон-деацетилази та гістон-метилтрансферази. І навпаки: Me-Lys9 розпізнається білком, котрий містить хромодомен і рекрутує ДНК-метилтрансферазу (рис. 6.10).

Хоча Me-Lys9 і 5mС є загальними маркерами конститутивно репресованих ділянок хроматину, не завжди репресія та додаткова компактизація залежить від НР1. Прикладом іншої системи є інактивація однієї з Х-хромосом у клітинах самок ссавців (див. підрозділ, присвячений генетиці статі). У складі Х-хромосоми, яка буде інактивованою (обирається випадково на ранніх стадіях розвитку), спрацьовує ген Xist, що продукує велику некодуючу молекулу РНК. Ці РНК укривають собою хромосому і взаємодіють з низкою білків, серед яких – гістонметилтрансфераза (здійснює метилювання Lys9 гістона Н3). Метилювання Lys9 зумовлює метилювання ДНК, що приводить до епігенетичного спадкування. Крім того, до Х-хромосоми рекрутуються структурні компактизуючі білки (але не НР1).

Гетерохроматин і РНК-інтерференція

Гетерохроматин утворюється в першу чергу на послідовностях ДНК, що повторюються. Причому має значення не послідовність як така, а саме наявність повторів: штучне введення повторів до геномної ділянки викликає утворення гетерохроматинової зони. У формуванні й підтриманні гетерохроматинового стану повторів (принаймні в центромерах) важливу роль відіграє процес РНК-інтер- ференції (див. розділ 2).

При порушенні компактизації на центромерних повторах може відбуватися спонтанна транскрипція в різних напрямках. Оскільки матрицею є повтори, існує висока ймовірність синтезу комплементарних молекул РНК: утвориться дволанцюгова РНК, яка запустить процес інтерференції – нуклеаза Dicer розрізає дволанцюгову РНК на фрагменти (можуть бути далі ампліфіковані РНК-залежною РНК-полімеразою), які залучаються до комплексу RISC. У складі комплексу РНК взаємодіють

183

Генетика

із транскриптами, і відбувається деградація останніх. Крім деградації, інтерференція має інший наслідок: RISC, який опиняється в зоні повторів, рекрутує до хроматину гістон-метилтрансферазу, яка здійснює метилювання Lys9 гістона Н3. За вже відомою схемою (рис. 6.9, 6.10) відбувається зв'язування НР1 і компактизація гетерохроматину.

Гетерохроматин формується також у зонах скупчення мобільних елементів. Активність мобільних елементів може контролюватися організмом – відповідну систему пригнічення транскрипції мобільних елементів, котрі використовують РНК як проміжну стадію, знайдено як у дрозофіли, так і в мишей. Система вмикається при сперматогенезі та складається з білків родини Piwi й коротких регуляторних РНК, комплементарних ділянкам мРНК, яка синтезується на мобільних елементах. Ці РНК і білки Piwi об'єднуються в комплекс. РНК спрямовує цей комплекс на мРНК мобільного елемента, білки комплексу здійснюють деградацію мРНК, що й запобігає переміщенню – загалом така система є аналогічною процесу РНК-інтерференції. Крім того, від присутності згаданих регуляторних РНК залежить також інтенсивне метилювання ДНК мобільних елементів, яке зумовлює конститутивну репресію їхньої транскрипції.

Ефект положення гена

Описаний досить давно ефект залежності прояву гена від його положення у хромосомі має безпосереднє відношення до епігенетичного спадкування гетерохроматинового стану.

Один із прикладів ефекту положення демонструє рис. 6.12: штучно індукована у статевих клітинах дрозофіли хромосомна перебудова з інверсією ділянки, яка на одному кінці містить ген w+ (червоні очі дикого типу), а на іншому – частину перицентромерної гетерохроматинової зони з межею, що не дозволяє гетерохроматину розповсюджуватися. Після такої інверсії на ранніх стадіях ембріонального розвитку гетерохроматин (який тепер не має межі) іноді поширюється на ген w+, що опинився поряд. Це приводить до вимкнення гена, і такий залежний від структури гетерохроматину репресований стан спадкується при мітозі. У результаті утворюються групи клітин білого кольору – мозаїчне око.

Якщо внаслідок хромосомних перебудов, нерівного кросинговеру або активності мобільних елементів поряд із гетерохроматиновою зоною опиняється група генів, то частота (імовірність) їхнього вимкнення залежить від порядку розташування – ген, що знаходиться ближче до гетерохроматинової ділянки, вимикається частіше.

184

Розділ 6. Генетика багатоклітинних еукаріотів

Межа

w+

Інверсія ділянки

w+

w+

Мозаїчне

око

Рис. 6.12. Приклад ефекту положення гена – утворення мозаїчного ока дрозофіли

ЦИТОПЛАЗМАТИЧНА СПАДКОВІСТЬ: ГЕНЕТИКА МІТОХОНДРІЙ І ХЛОРОПЛАСТІВ

Переважна більшість еукаріотичних генів міститься в клітинному ядрі. Крім ядра, свій власний генетичний матеріал мають цитоплазматичні органели еукаріотичної клітини: мітохондрії та хлоропласти. Геноми цих органел містять гени білків і РНК, необхідні для їхнього функціонування. За своєю організацією геноми органел значно відрізняються від ядерного геному й нагадують геноми прокаріотів. Молекулярна машинерія, яка забезпечує експресію генетичної інформації в органелах, також подібна до прокаріотичної. Ці факти лягли в основу ендосимбіотичної теорії походження мітохондрій і пластид, відповідно до якої органели виникли в результаті незалежних ендосимбіотичних подій: вільно існуючі α-протобактерії та ціанобактерії були захоплені протоеукаріотичною клітиною-хазяїном і еволюціонували у специфічні органели (мітохондрії та хлоропласти відповідно), які відповідають за дихання та фотосинтез. Під час коеволюції клітинихазяїна й ендосимбіонта частина мітохондріальних і хлоропластних генів (інколи досить значна частина) була перенесена в ядерний ге-

185

Генетика

ном. Таким чином, наявність власного генетичного апарату забезпечує мітохондріям і хлоропластам своєрідну автономність від ядерного геному, але велика кількість компонентів, потрібних для виконання їхніх функцій, кодується ядерним геномом.

Геноми мітохондрій

Мітохондрії, які присутні практично в усіх еукаріотів за деякими винятками, відіграють центральну роль у синтезі АТР і деяких інших важливих фізіологічних процесах. Кількість мітохондрій на одну клітину може варіювати від декількох штук (наприклад, у сперміях) до декількох тисяч (у гепатоцитах). Кожна мітохондрія може нести декілька копій ДНК (мтДНК), які в комплексі з білками утворюють структуру, подібну до нуклеоїдів прокаріотів.

Генетичний код, що використовується власною системою трансляції мітохондрій, характеризується деякими відхиленнями від універсальної таблиці відповідності кодонів амінокислотам (див. рис. 2.1). Зокрема, універсальний стоп-кодон UGA в мітохондіях більшості видів кодує триптофан, у мітохондіях дріжджів кодон CUG відповідає треоніну замість лейцину, у мітохондріях ссавців AUA відповідає метіоніну замість ізолейцину тощо.

Популярною є думка, що більшість еукаріотів мають кільцеву молекулу мтДНК. Часто так воно і є, проте останнім часом накопичилися дані про те, що у великої кількості еукаріотів мтДНК є лінійною (малярійний плазмодій, гідра, деякі гриби та одноклітинні водорості). Іноді, наприклад у дріжджів, лінійна молекула мтДНК являє собою так званий конкатомер – складається з великих однакових ділянок послідовності, що тандемно повторюються. Лінійні мтДНК характеризуються наявністю специфічних кінцевих структур: ковалентно замкнені на кінцях комплементарні ланцюги, приєднані до кінців молекули специфічні термінальні білки або теломероподібні кінцеві повтори різноманітної довжини.

Зазвичай мітохондріальні геноми (мітохондріоми) представлені однією "хромосомою", однак є винятки. Так, мітохондрії гриба Spizellomyces punctatus містять три різні кільцеві молекули ДНК. У найпростішого Amoebidium parasiticum мітохондріом складається

здекількох сотень лінійних молекул, які різняться за розмірами й послідовністю. Мітохондріальний геном рослин, як правило, складається

здекількох молекул різного розміру. Одна з них, "основна хромосома", містить більшу частину генів, а кільцеві форми меншого розміру, які

186

Розділ 6. Генетика багатоклітинних еукаріотів

перебувають в динамічній рівновазі як між собою, так і з основною хромосомою, утворюються внаслідок внутрішньота міжмолекулярної рекомбінації завдяки наявності гомологічних ділянок (рис. 6.13). Перебудови геномів мітохондрій у результаті рекомбінаційних подій, ведуть до делецій, дуплікацій, інверсій або інсерцій певних нуклеотидних послідовностей або цілих генів. Такі зміни можуть викликати не тільки ушкодження наявних генів, але й появу нових працюючих генів. Вважають, що ця зміна структури мітохондріального геному контролюється ядром і є одним із механізмів регуляції ефективності експресії мітохондріальних генів.

Рис. 6.13. Схема утворення кільцевих молекул різного розміру в мітохондріях рослин. Рекомбінація відбувається по гомологічних ділянках,

забарвлених однаковим кольором

Мітохондріальні геноми значно варіюють за розмірами: від 6 тис. пар основ у плазмодіїв до 2 млн 400 тис. пар основ у сітчастої дині. У тварин мтДНК має в основному невеликі розміри – у середньому 13–19 тис. пар основ. Відносно великі мітохондріоми (від 20 до 42 тис. пар основ) знайдені в молюсків, нематод і деяких комах. Мітохондріоми вищих рослини мають великі розміри (від 180 до 2 млн 500 тис. пар основ), містять значну кількість послідовностей, що повторюються, і відкритих рамок зчитування з невідомими функціями. Характерним для мітохондріомів рослин є наявність вбудованих ділянок хлоропластної ДНК.

187

Генетика

Набір генів у мітохондріальних геномах варіює від 5 у плазмодіїв до 100 у джгутикового Reclinomonas americana. Для більшості еукаріотів середня кількість генів, які кодує мітохондріом, становить 40–50, з яких 12–20 є білковими. Геноми мітохондрій усіх еукаріотів кодують рРНК великої та малої субодиниць мітохондріальної рибосоми, а також частковий (інколи повний) набір власних тРНК. Білки, що кодуються мітохондріомами, в основному залучені до процесів перенесення електрона та синтезу АТР: субодиниця АТР-синтази (ген atp), компоненти комплексів дихального ланцюга (гени nad, sdh, cob, cox). У мтДНК рослин і деяких одноклітинних містяться гени рибосомних білків. Дещо атиповим за складом генів є мітохондріом дріжджів – він містить, зокрема, гени ендонуклеаз і зворотної транскриптази.

Різниця в розмірах мітохондріомів викликана некодуючими послідовностями – кореляція між розміром мтДНК і кількістю генів практично відсутня. Особливо велика кількість некодуючих послідовностей мтДНК (50–70 %) є характерною для вищих рослин. Частина таких послідовностей входить до складу інтронів (в основному зустрічаються в мітохондріальних генах грибів і вищих рослин, у генах ссавців інтрони відсутні), які видаляються з транскриптів під час сплайсингу. Більша частина некодуючих ділянок представлена міжгенними регіонами.

Усі компоненти реплікативного, транскрипційного та частина трансляційного апаратів мітохондрій кодуються ядерним геномом. Отже, експресія мітохондріальних генів перебуває під повним контролем ядра.

Геном хлоропластів

Хлоропласти вищих рослин містять багато ідентичних кільцевих дволанцюгових молекул ДНК, розміри яких коливаються від 120 до 220 тис. пар основ. Характерною особливістю хлоропластної ДНК (хлДНК) вищих рослин є наявність інвертованого повтору (ІП), довжина якого в середньому становить 20–30 тис. пар основ (варіює в різних видів від 5 до 76 тис. пар основ). У результаті гени, локалізовані в ІП, є дуплікованими в геномі хлоропластів. Відмінності за розмірами хлДНК різних видів в основному визначаються довжиною ІП. Винятком є хлДНК деяких бобових і хвойних, які не містять ІП. Вважають, що ІП був у загального предка вищих рослин.

Як правило, ІП представлений двома сегментами (ІП-1 та ІП-2), що розділяють хлДНК на велику й малу унікальні ділянки (рис. 6.14). Велика унікальна ділянка є найбільш варіабельною (для різних видів) частиною молекули. У деяких видів у процесі еволюції один сегмент ІП був повністю або частково втрачений.

188

Розділ 6. Генетика багатоклітинних еукаріотів

Велика унікальна послідовність

Мала унікальна послідовність

Рис. 6.14. Схема організації хлоропластного геному тютюну, ІП – інвертований повтор.

Вражає подібність організації хлоропластного й бактеріального геномів. Основні регуляторні послідовності, такі як промотори і термінатори, в обох геномах фактично ідентичні. Білки, що кодуються хлоропластними генами, дуже схожі на бактеріальні, а деякі групи генів із близькими функціями (скажімо, гени рибосомних білків) організовані однаково в геномах хлоропластів, Е. coli та ціанобактерій. Разом із тим, на відміну від прокаріотів, у генах хлДНК присутні інтрони.

Велика кількість генів локалізована в кластерах, що експресуються у вигляді великих поліцистронних первинних транскриптів. Останні процесуються до оліго- і моноцистронних мРНК, що піддаються сплайсингу та редагуванню. Редагування транскриптів хлоропластних генів виявлено тільки у вищих рослин; найчастіше спостерігаються заміни С → U шляхом дезамінування. Аналогічний процес, що викликає заміни амінокислотних залишків у відповідних білках, відбувається і в мітохондріях деяких еукаріотів (найпростіших, грибів і рослин).

За складом і порядком розміщення генів хлоропластні геноми вищих рослин є високо консервативними. У вивчених геномах хлоропластів вищих рослин виявлено від 108 до 122 генів, 95 з яких є однаковими й зустрічаються в усіх видів. За функціональністю гени хлоропластів можна розділити на три групи: гени апаратів транскрипції та трансляції; гени, що пов'язані з фотосинтезом; гени фото-

189

Генетика

синтетичного метаболізму (біосинтезу амінокислот, жирних кислот, пігментів тощо). До генів першої групи відносять гени рРНК, тРНК (близько 30), деяких субодиниць хлоропластної РНК-полімерази, приблизно 20 генів рибосомних білків і кількох факторів трансляції. До другої групи – гени, що кодують деякі білки, які є компонентами фотосистем I і II, комплексу цитохромів b/f, АТР-синтази, субодиниць NADH-дегідрогеназного комплексу дихального ланцюга та велику субодиницю ключового ферменту фотосинтезу рибулозобісфосфаткарбоксилази. Гени третьої групи найменш вивчені. До неї відносять ген accD, що кодує β-субодиницю ацетил-СоА-карбокси- лази прокаріотичного типу, яка бере участь у біосинтезі жирних кислот. Геноми хлоропластів злаків не мають гена accD. У мохоподібних і голонасінних виявлено гени, пов'язані з біосинтезом хлорофілу. Їх було ідентифіковано за схожістю з відповідними генами фотосинтезуючих бактерій.

Усі відомі білки, які кодуються в хлоропластах, входять до складу великих ферментативних комплексів. Ці комплекси також містять одну або декілька субодиниць, що кодуються ядерним геномом. Цікаво, що субодиниці, котрі кодуються ядерним геномом, є регуляторними, а ті, що кодуються хлДНК, – каталітичними. Усі найважливіші білки, які беруть участь у реплікації, транскрипції та трансляції також кодуються ядерним геномом. Тобто, як і для мітохондрій, усі процеси, що відбуваються у хлоропластах, перебувають під жорстким контролем ядра.

Основні характеристики спадкування генів органел

У диплоїдних видів еукаріотів ядерні гени зумовлюють успадкування ознак за законами Менделя в результаті того, що, за винятком зчеплених зі статтю ознак, нащадки отримують по одній копії кожного гена від обох батьків. Мітохондрії та пластиди не розподіляються по гаметах і дочірніх клітинах аналогічно хромосомам ядра, тому закономірності спадкування генів органел і ознак, які вони зумовлюють, значно відхиляються від менделівських. Оскільки мітохондрії та пластиди знаходяться в цитоплазмі клітин, такий тип спадкування нази-

вається позаядерним (позахромосомним), або цитоплазматичним.

Особливості позаядерного спадкування зумовлені в першу чергу тим, що гамети різних статей мають непорівнянні кількості мітохондрій і пластид. Найчастіше жіночі гамети містять тисячі мітохондрій (і пластид у рослин), а чоловічі – одиниці. У результаті в зиготі переважають міто-

190