Genetics_sivolob_et_al

Розділ 4. Мінливість генетичного матеріалу

тина (чи організм), яка містить одну додаткову хромосому, має назву трисомік. Утрата однієї хромосоми приводить до моносомії, двох гомологічних хромосом – до нулісомії.

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ МУТАЦІЙНОЇ МІНЛИВОСТІ

Джерелом мутаційних змін є перебудови послідовності нуклеотидів ДНК, які виникають у результаті хімічних модифікацій молекули, таутомеризації азотистих основ, переміщення мобільних елементів (див. розділ 6), інтеграції чужорідної, (наприклад, вірусної) ДНК і помилок під час реплікації та репарації. Пошкодження ДНК не є власне мутаціями, а лише передмутаційними змінами, які можуть бути або виправлені системами репарації, або зафіксовані в ДНК у вигляді мутацій. Тобто мутація є такою зміною послідовності ДНК, яка залишилась після репарації та наступної чергової реплікації.

Пошкодження ДНК можуть виникати внаслідок як впливу продуктів нормальної життєдіяльності клітини, так і дії зовнішніх факторів середовища. Ендогенні та екзогенні фактори, здатні пошкоджувати ДНК, називають мутагенами, а процес утворення мутацій – мутагенезом. Мутагенез, який відбувається у природних умовах, конкретні причини якого, як правило, важко ідентифікувати, – це спонтанний мутагенез. Якщо мутації викликаються штучно (при використанні мутагенних факторів у експериментах), кажуть про індукований мутагенез. Молекулярні механізми виникнення пошкоджень ДНК і фіксації їх у вигляді мутацій принципово не відрізняються для обох типів мутагенезу.

Пошкодження ДНК, що виникають у процесі життєдіяльності клітини

Поява передмутаційних змін генетичного матеріалу в клітині унаслідок метаболічних процесів є нормальним явищем. Кількість спонтанних пошкоджень ДНК, що виникають у одній клітині людини за добу, оцінюється в 104–106. Переважна частина цих пошкоджень у нормі видаляється системами репарації, і тільки невелика кількість залишається у вигляді мутації.

131

Генетика

Найпоширенішими передмутаційними пошкодженнями ДНК є втрати азотистих основ (утворення апуринових або апіримідинових сайтів), хімічні модифікації основ, ковалентні зшивання ДНК-ДНК і ДНК-білок, однота дволанцюгові розриви цукрофосфатного остова ДНК. Ці пошкодження виникають здебільшого в реакціях гідролізу (хімічні реакції з водою), реакціях з активними радикалами оксигену та пероксидними радикалами, а також унаслідок метилування (алкілування) основ.

Гідроліз глікозидного зв'язку між азотистою основою та дезоксирибозою (див. рис. 1.1) приводить до видалення азотистої основи й появи в цьому місці апуринового чи апіримідинового сайта (АП-сайта). За добу в клітинній ДНК утворюється близько 10 тис. таких АП-сайтів. Неправильна репарація цих пошкоджень може зумовити нуклеотидні заміни (транзиції чи трансверсії). Відсутність репарації стане причиною того, що під час наступного реплікаційного циклу напроти АП-сайта у складі матричного ланцюга в ланцюзі, що синтезується, буде вставлено довільний нуклеотид – з імовірністю 3/4 він виявиться не тим, що мав би стояти в цьому місці, тобто виникне точкова мутація типу нуклеотидної заміни. Крім того, ДНК-полімеразний комплекс може "проскочити" АП-сайт у складі матриці, наслідком чого буде делеція нуклеотиду в складі ланцюга, що синтезується.

Нерепаровані АП-сайти можуть також перетворюватися на одноланцюгові розриви. Накопичення одноланцюгових розривів, у свою чергу, приводить до розривів дволанцюгових (коли два одноланцюгові розриви розташовані на невеликій відстані та на різних ланцюгах), що може бути причиною утворення різних типів хромосомних аберацій. Одноланцюгові розриви ДНК можуть виникати також у результаті прямого гідролізу фосфодіефірного зв'язку.

При гідролізі екзоциклічних аміногруп азотистих основ вини-

кає дезамінування основ (до 500 пошкоджень на клітину за добу). Так, у результаті дезамінування цитозин перетворюється на урацил (див. рис. 1.2), а 5-метилцитозин – на тимін. Обидві основи, що з'явилися внаслідок таких перетворень, комплементарні аденіну, а отже, у разі відсутності репарації дезамінування може зумовити нуклеотидну заміну (стабільну заміну пари GC на AT-пару при реплікації).

Оксидативні пошкодження ДНК виникають в результаті хімічних реакцій дезоксирибози та азотистих основ із вільними радикалами оксигену або пероксидними радикалами. Джерелом радикалів є процеси дихання клітини. Найсуттєвіші оксидативні пошкодження ДНК –

132

Розділ 4. Мінливість генетичного матеріалу

це утворення 8-оксигуаніну (приєднання оксигену до восьмого атома кільця, див. рис. 1.2), комплементарного тиміну, і 2-оксиаденіну, комплементарного цитозину. Продуктами реакцій з вільними радикалами є також одноланцюгові розриви та зшивання ДНК-ДНК або ДНК-білок, які можуть бути причинами хромосомних аберацій.

Ще одним механізмом виникнення передмутаційних пошкоджень ДНК є метилування основ по атомах, які в нормі не піддаються цій модифікації. Помилки метилування викликають появу таких суттєвих пошкоджень ДНК: утворення 7-метилгуаніну, 3-метиладеніну та О6-ме- тиладеніну. 7-Метилгуанін і 3-метиладенін перешкоджають нормальному проходженню реплікації, унаслідок чого відбувається утворення однолацюгових прогалин (ділянок недореплікації) напроти модифікованих нуклеотидів. О6-метиладенін є комплементарним цитозину й може бути причиною транзицій.

Помилки реплікації та репарації

Помилкове включення нуклеотидів під час реплікації є досить вагомою причиною виникнення точкових мутацій і хромосомних перебудов. Утворення некомплементарних пар нуклеотидів (місметчів) під час реплікації відбувається з частотою 1 на 10 тис. нуклеотидних пар. Основною причиною помилкового приєднання нуклеотидів під час реплікації є таутомерія азотистих основ. Спонтанні перебудови електронних систем гетероциклів приводять до існування кожної основи у вигляді двох таутомерних форм: аміночи іміноформи для A, C; енольної чи кетоформи для G, T (рис. 4.6). Рівновага зсунута в бік амінота кетоформ, які й присутні у складі подвійних спіралей (див. також рис. 1.2) і для яких реалізуються правила комплементарності A-T, G-C. Але спарювання основ підпорядковується іншим правилам для мінорних таутомерних форм: наприклад, іміноформа А та аміноформа С утворюють між собою два водневі зв'язки (рис. 4.6), що може відбутися під час впізнання матриці черговим нуклеотидом при реплікації. Аналогічно, енольна форма тиміну є комплементарною гуаніну. У результаті швидкого повернення до мажорної таутомерної форми, у складі ДНК залишиться некомплементарна пара нуклеотидів. Якщо система редагування помилок під час синтезу ДНК і потім система репарації місметчів (див. розділ 1) не спрацює, у наступному реплікативному циклі така некомплементарна пара зафіксується у вигляді мутації в одній із двох дочірніх молекул.

133

Генетика

Рис. 4.6. Таутомерні форми азотистих основ, унизу – комплементарна пара іміноформи аденіну та аміноформи цитозину

На ділянках мікросателітних тандемних повторів (повторів елементів послідовності довжиною 1–15 пар основ, розділ 6) спостерігається специфічна помилка ДНК-полімеразного комплексу – проковзування (slippage) ДНК-полімерази. На ділянці матричного або новосинтезованого ланцюгів ДНК інколи відбувається утворення мікропетель або мікрошпильок за рахунок внутрішньоланцюгових комплементарних взаємодій. У випадку появи мікропетлі на матричному ланцюзі ДНК дочірній ланцюг буде коротший на кілька нуклеотидів, і отже, після наступного раунду реплікації буде спостерігатися делеція (рис. 4.7, а). Якщо така мікропетля утворюється в дочірньому ланцюзі, кількість нуклеотидів у ньому збільшиться, що приведе до вставки одного або декількох повторів (рис. 4.7, б).

134

Розділ 4. Мінливість генетичного матеріалу

а

Рис. 4.7. Зменшення (а) і збільшення (б) кількості повторів при утворенні мікропетлі в ДНК під час реплікації.

Мутації виникають не тільки внаслідок недостатньо ефективної репарації – деякі процеси репарації ДНК самі є причинами мутацій. Насамперед це стосується неточних систем репарації: SOS-репарації, яка зумовлює неточний синтез ДНК у разі великої кількості пошкоджень, що викликає ще більше зростання мутацій, і системи репарації дволанцюгових розривів за рахунок негомологічного з'єднання кінців NHEJ (див. розділ 1). Саме NHEJ вважається основною причиною реалізації хромосомних перебудов, оскільки забезпечує з'єднання кінців будь-яких молекул ДНК.

135

Генетика

Механізми виникнення поліплоїдій і анеуплодій

Кількісні аномалії хромосом пов'язані з порушенням процесів, які забезпечують розходження хромосом (хроматид) у мітозі та мейозі. Причиною помилок розподілу хромосом можуть бути порушення контролю клітинного поділу, дефекти в центромерній області хромосом

іпошкодження мікротрубочок веретена поділу. Залежно від того, як саме виникла аномалія в кількості хромосом (у результаті мітотичного чи мейотичного поділу), розрізняють соматичну й мейотичну поліплоїдію та анеуплодію.

Одним із механізмів виникнення автополіплоїдних клітин є явище ендореплікації ДНК: клітина проходить декілька циклів реплікації без подальшого виходу в мітоз. Інший механізм – порушення мікротрубочок веретена поділу, що приводить до нерозходження хромосом або хроматид. Поліплоїдію можна викликати і штучним шляхом, застосовуючи речовини – блокатори мітозу (колхіцин, колцемід та ін.). Ці сполуки та їхні аналоги інгібують утворення мікротрубочок веретена поділу,

іхромосоми після реплікації не розходяться до полюсів клітини. Крім того, автополіплоїдні клітини можна отримати шляхом блокування не власне поділу ядра (каріокінезу), а поділу цитоплазми (цитокінезу). Два диплоїдних ядра, залишаючись в одній цитоплазмі, при об'єднанні створюють клітину з тетраплоїдним набором хромосом.

Алополіплоїди утворюються штучним шляхом за рахунок міжвидової гібридизації.

Усі типи анеуплоїдій є результатом нерозходження окремих хромосом (чи хроматид) при поділі клітини – мітозі чи мейозі (рис. 4.8). Найчастіше нерозходження хромосом пов'язане з дефектом центромерної ділянки: така хромосома не прикріплюється до веретена поділу й опиняється в одній дочірній клітині разом зі своїм гомологом, інша дочірня клітина виявляється позбавленою однієї хромосоми. Отже, усі форми анеуплодій (моносомія і трисомія, нулісомія і трисомія) можуть бути результатом одного циклу неправильного розподілу хромосом. При мейотичному поділі нерозходження хромосом може відбуватися як у першому, так і в другому поділі.

Поліплоїдні та анеуплоїдні клітини характеризуються порушенням процесів мейозу. Так, при утворенні гамет у поліполоїдів замість бівалентів (див. розділ 1) можуть утворюватися три-, тетрата уніваленти, що порушує сегрегацію хромосом і викликає появу нових геномних мутацій. Крім того, дисбаланс у кількості хромосом приводить до аномальних мітотичних поділів.

136

Розділ 4. Мінливість генетичного матеріалу

a

б

Рис. 4.8. Схема утворення анеуплоїдних клітин при першому мейотичному поділі (а)

і при другому мейотичному поділі чи мітозі (б)

Індукція мутацій мутагенними факторами

За своєю природою мутагени поділяють на фізичні, хімічні та біологічні. Коли мутагенний фактор безпосередньо взаємодіє з ДНК і викликає пошкодження, говорять про пряму дію мутагену. Мутаген може не взаємодіяти з ДНК, але запускати каскад процесів, які в кінцевому наслідку приводять до появи пошкоджень (або до інгібування їхньої репарації). У цьому випадку йдеться про опосередковану дію мутагену. Більшість мутагенних факторів, незалежно від їхньої природи, мають як пряму, так і опосередковану дію. Майже всі мутагени є одночасно й канцерогенами, тобто вони здатні стимулювати розвиток пухлин.

Хімічні мутагени за своєю структурою та механізмами дії являють собою дуже різноманітну групу сполук. Хімічні мутагени можуть бути нормальними метаболітами клітини – аутомутагени, або потрапляти в організм (клітину) ззовні – ксенобіотики. Найчастіше хімічні мутагени класифікують за хімічною структурою або за типом реакції з ДНК.

137

Генетика

Деякі хімічні мутагени є аналогами азотистих основ. Вони за структурою подібні до нормальних основ і можуть використовуватися ферментами, які забезпечують процеси синтезу нуклеїнових кислот. Наприклад, 5-бромурацил є аналогом тиміну і, відповідно, може включатися замість нього в ДНК. Проте, на відміну від тиміну, 5-бромурацил значно легше піддається таутомерізації: у результаті в наступному реплікаційному циклі напроти 5-бромурацилу до ДНК часто включається гуанін.

Ароматичні сполуки, здатні до інтеркаляції (вбудовування) між сусідніми парами основ подвійної спіралі ДНК, належать до інтеркалюючих мутагенних чинників. Прикладами є бромистий етидій і дауноміцин (рис. 4.9, а, б), профлавін, актиноміцин D тощо – планарні молекули, які за розміром наближаються до пурин-піримідинової пари. Вбудовуючись у подвійну спіраль, інтеркалятор удвічі збільшує відстань між сусідніми парами основ (рис. 4.9, в). Під час реплікації відбувається інсерція додаткового нуклеотиду в місці інтеркаляції, що призводить до мутації – зсуву рамки зчитування.

Br- N+

H2NNH2

Рис. 4.9. Хімічні формули бромистого етидію (а) і дауноміцину (б)

і структура комплексу інтеркальованої похідної дауноміцину (червона) з ДНК (в, зображення створено за допомогою програми PyMOL,

код структури у Protein Data Bank 1NAB)

Різноманітні природні та синтетичні речовини, взаємодіючи з ДНК, викликають хімічні модифікації азотистих основ. Скажімо, сильні окисники, такі як азотиста кислота або біхромат калію, ви-

138

Розділ 4. Мінливість генетичного матеріалу

кликають окисне дезамінування основ. Алкілуючі агенти (нітрозометилсечовина, тіофосфамід та інші) приєднують алкільні радикали як екзоциклічні групи азотистих основ.

Деякі хімічно інертні молекули, що потрапляють в організм, набувають мутагенних властивостей тільки внаслідок їхніх метаболічних перетворень – метаболічної активації. Такі хімічні речовини називають промутагенами – це, наприклад, гідрофобні поліциклічні ароматичні вуглеводні, афлотоксин (токсин, що синтезується багатьма мукоровими цвілевими грибами).

Узагалі, пошкодження ДНК хімічними речовинами далеко не завжди спричиняється безпосередньою взаємодією мутагену з азотистими основами чи цукрофосфатним остовом. Часто хімічні речовини вступають у складні внутрішньоклітинні реакції, що супроводжуються появою вільних радикалів, які пошкоджують ДНК. Генераторами вільних радикалів можуть виступати сильні окисники, солі металів, деякі антибіотики, наприклад блеоміцин. Хімічними мутагенами, які не взаємодіють з ДНК, є також інгібітори ферментів метаболізму нуклеїнових кислот і репарації. Так, сильним інгібітором систем репарації ДНК є алкалоїд кофеїн. Аналог тиміну – 5-фторурацил – сам у ДНК не вбудовується, а є інгібітором ферменту тимідилатсинтетази. Результатом є нестача тимінових нуклеотидів у клітині, що може бути причиною утворення одноланцюгових прогалин при реплікації ДНК.

Фізичні мутагенні фактори представлені електромагнітним випромінюванням із довжиною хвилі менше 300 нм і корпускулярними випромінюваннями. Іонізуюче випромінювання (рентгенівські та γ-промені, α- і β-частинки) викликає іонізацію молекул – втрату чи приєднання електронів, унаслідок чого утворюються позитивно чи негативно заряджені радикали компонентів нуклеїнових кислот. Хімічні реакції між цими радикалами викликають руйнування різноманітних ковалентних зв'язків: фосфодіефірних, глікозидних, зв'язків усередині азотистих основ і цукрів. Подібні процеси індукують як точкові, так і хромосомні мутації всіх типів. Крім прямої дії на ДНК, іонізуюче випромінювання індукує появу вільних гідроксильних і пероксидних радикалів, які підсилюють пряму мутагенну дію іонізуючої радіації.

Серед неіонізуючого випромінювання найбільшу мутагенну активність мають ультрафіолетові промені короткохвильового діапазону (100–280 нм). Саме в цій спектральній області знаходяться максимуми поглинання світла азотистими основами. Поглинання енергії ультрафіолетових променів веде до збудження електронів – їхнім переходам на вищі енергетичні рівні, що дає можливість проходженню фотохімічних реакцій між азотистими основами. Найчастіше продуктами таких реак-

139

Генетика

цій є піримідинові димери, наприклад, між сусідніми (по одному ланцюгу) тимінами (див. рис. 1.18). Довгохвильовий максимум поглинання основ припадає на 260 нм: світло з довжиною хвилі понад 280 нм практично не поглинається ДНК. Певна мутагенна активність довгохвильового ультрафіолету пояснюється поглинанням енергії іншими хромофорами (наприклад, деякими коферментами) із подальшою передачею електронного збудження на ДНК. Крім того, поглинута енергія може також бути причиною генерації вільних радикалів деякими молекулами (скажімо, рибофлавіном).

До біологічних мутагенних факторів відносяться віруси, бактерії,

паразити. Основною причиною мутагенної активності вірусів (ретровірусів і вірусів, що містять ДНК, див. розділ 5) є інтеграція їхніх ДНК у геном хазяїна. Інтеграція в межах кодуючої або регуляторної ділянки гена може викликати мутацію або вплинути на нормальну експресію. Мутацію може спричинити екзогенна ДНК, штучно введена в клітину. Подібний механізм мутагенезу є цілком подібним до ефектів переміщення мобільних елементів (розділ 6). Крім того, причиною збільшення загального рівня мутацій у клітинах, оброблених екзогенною ДНК або заражених вірусами, є "конкуренція" чужорідної ДНК із клітинною за молекулярну машинерію систем репарації.

Зростання рівня мутацій різного типу, що спостерігається в соматичних клітинах організмів, які піддалися вірусним, бактеріальним та іншим інфекціям, носить назву інфекційного мутагенезу. Інфекційний мутагенез пояснюється комплексом процесів, що відбуваються при взаємодії організму хазяїна з інфекційним агентом або паразитом. Причиною мутацій можуть бути, наприклад, токсини, які виділяють бактерії та паразити, токсичні метаболіти й речовини, синтезовані організмом при реакціях імунної відповіді.

НАСЛІДКИ МУТАЦІЙНОЇ МІНЛИВОСТІ

Загальним наслідком мутаційної мінливості є порушення спадкових програм клітин і організмів. Але при цьому мутаційна мінливість спричиняє підвищення біологічного різноманіття: забезпечує появу нових геномних варіантів і, відповідно, генотипових і фенотипових форм. Більшість з утворених варіантів геному є відносно нейтральними. Велика частина новоутворених фенотипів є або нежиттєздатними (прояв летальних мутацій), або мають знижену життєздатність (прояв напівлетальних мутацій). Проте інколи нові варіанти набува-

140