4. Основы кинетики ферментативного катализа

Ферментативная кинетика исследует влияние химической природы реагирующих веществ и условий их взаимодействия на скорость ферментативной реакции.

Л. Михаэлис и М. Ментен разработали общую теорию ферментативной кинетики. Они исходили из предположения, что ферментативный процесс протекает в виде следующей химической реакции:

[E] + [S] ↔ [ES] → [P] + [E]

Фермент [E] образует с субстратом [S] фермент-субстратный комплекс [ES], распадающийся с образованием продукта реакции [P] и свободного фермента [E].

К ферментативным реакциям применимы общие принципы кинетики химических реакций. Любая химическая реакция характеризуется константой равновесия К_р. Для реакции, представленной на схеме, константа равновесия равна отношению произведения концентраций образующихся веществ к произведению концентраций исходных веществ:

В состоянии равновесия скорость прямой (v₊₁) и обратной (v_–1) реакций равны:

v₊₁ = k _{+ 1}[ А ] • [ B ]

v_–1 = k _{– 1} [ С ] • [ D ] ,

v₊₁ = v_–1

Соответственно k₊₁[А]•[B] = k_–1[С]•[D], или

Таким образом, константа равновесия равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакций.

В случае ферментативной реакции величину, обратную константе равновесия, называют субстратной константой или константой диссоциации фермент–субстратного комплекса и обозначают символом K_S.

K_S определяет степень сродства субстрата и фермента: чем ниже значение K_S, тем выше сродство.

Скорость катализируемых ферментами реакций зависит от природы фермента, обладающего низкой или высокой активностью, а также от концентрации субстрата, наличия в среде активаторов или ингибиторов, температуры и реакции среды (рН).

При условии избытка субстрата скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации фермента:

Важным отличием ферментативных реакций от обычных химических реакций является насыщение фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 6 (а)) является почти линейной, подчиняется кинетике первого порядка и в любой момент времени t определяется следующим кинетическим уравнением:

где [S] – молярная концентрации субстрата ; –d[S]/dt – скорость убыли субстрата; k' – константа скорости реакции , которая в данном случае имеет размерность, обратную единице времени (мин^–1 или с^–1).

При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна, становится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата [ S ] . В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка v = k" (при полном насыщении фермента субстратом) и целиком определяется концентрацией фермента.

Рис.6. Теоретический график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента:

(а) - реакция первого порядка (при [ S ] < К_m скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата);

(б) - реакция смешанного порядка;

(в) - реакция нулевого порядка, когда v = V_max и скорость реакции не зависит от концентрации субстрата.

. В стационарном состоянии, при котором образование фермент-субстратного комплекса ES уравновешивается его превращением в продукт P, зависимость скорости (v) ферментативного превращения субстрата от его концентрации [S] описывается уравнением Михаэлиса – Ментен:

где K_S – субстратная константа , характеризующая активность фермента, V_max – максимальная скорость реакции при данной суммарной концентрации фермента. Из этого уравнения следует, что при малых [S] скорость реакции возрастает пропорционально концентрации субстрата. Однако при достаточно большом увеличении последней эта пропорциональность исчезает: скорость реакции перестает зависеть от [S] – наступает насыщение, когда все молекулы фермента оказываются занятыми субстратом. Позднее было предложено усовершенствованное уравнение Бриггса-Холдейна:

где К_m представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся экспериментально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:

Рис. 4.13. Кривая уравнения Михаэлиса-Ментен: гиперболическая зависимость начальных скоростей катализируемой ферментом реакций от концентрации субстрата.

В числителе представлены константы скоростей распада комплекса ES в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение k_–1/ k₊₁представляет собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса K_S, тогда:

Для определения численного значения К_m обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от максимальной V_max, т.е. если v = ¹/₂ V_maх. Подставляя значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем:

Разделив обе части уравнения на V_mах, получим

Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной. При этом в комплексе с субстратом находится половина молекул фермента. Определение величины К_m имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т.д.

Для более удобного графического представления экспериментальных данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Холдейна по методу двойных обратных величин исходя из того принципа, что если существует равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины также будут равны. В частности, если

или

то после преобразования получаем уравнение:

которое получило название уравнения Лайнуивера–Бэрка. Это уравнение прямой линии: у = ах + b. Если теперь в соответствии с этим уравнением построить график в координатах 1/v (y) от l/[S] (x), то получим прямую линию (рис. 4.14), тангенс угла наклона который будет равен величине K_m/V_max; отрезок, отсекаемый прямой от оси ординат, представляет собой l/V_max(обратная величина максимальной скорости). Если продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на абсциссе отсекается отрезок, соответствующий обратной величине константы Михаэлиса – 1/К_m (см. рис. 4.14). Таким образом, величину К_m можно вычислить из данных наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от оси ординат, или из длины отрезка, отсекаемого от оси абсцисс в области отрицательных значений.

Рис. 4.14. График Лайнуивера-Бэрка.

Данный метод нашел широкое применение в современной энзимологии.

Следует отметить некоторые ограничения применения уравнения Ми-хаэлиса–Ментен, обусловленные множественными формами ферментов и аллостерической природой фермента. В этом случае график зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата - кинетическая кривая) имеет не гиперболическую форму, а сигмоидный характер (рис.) .

Рис. Сигмоидная кинетическая кривая насыщения субстратом.

Это означает, что связывание одной молекулы субстрата в одном каталитическом центре повышает связывание субстрата с другим центром, т.е. имеет место кооперативное взаимодействие.