Лабораторная работа № 3. Способы культивирования и идентификации микроорганизмов разных физиологических групп
Для объективности оценки качества и безопасности пищевых продуктов определяющее значение имеет выбор способа культивирования и эффективность идентификации производственной и посторонней микрофлоры.
При идентификации микроорганизмов учитывают:
морфолого-цитологические признаки. К ним относятся строение, форма и размеры клеток, их взаимное расположение, тинкториальные свойства (особенности при окрашивании различными красителями), способность к образованию спор и капсул, подвижность, наличие жгутиков, образование в клетках некоторых включений, особенности размножения;
физиолого-биохимические признаки. При изучении физиолого-биохимических признаков устанавливают отношение микроорганизмов к различным источникам углерода и азота, потребность в кислороде, температурные границы роста, солеустойчивость, чувствительность к антибиотикам, ферментативные тесты;
культуральные признаки. К таким признакам относятся особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.
К настоящему времени разработано несколько способов культивирования микроорганизмов на средах: периодическое, непрерывное культивирование и культивирование иммобилизованных клеток.
Наиболее распространен способ периодического культивирования. При данном способе инокулят вносится в питательную среду, которая содержит заданное количество всех необходимых питательных веществ. При этом ни один из существенных компонентов питательной среды не поступает в систему в процессе культивирования, т.е. это закрытая система. Периодическое культивирование возможно как поверхностных культур (на поверхности твердой питательной среды), так и глубинных культур (в жидкой питательной среде). При внесении микроорганизмов в питательную среду их рост прекращается тогда, когда содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды достигает минимума или в среде накапливаются продукты метаболизма, ингибирующие рост микроорганизмов.
Второй способ культивирования микроорганизмов - рост в непрерывной культуре. Все компоненты питательной среды постоянно поступают в систему и выводятся из нее. Это открытая система осуществляется только в глубинной культуре, чаще всего аэрируемой.
Третий - культивирование иммобилизованных клеток. Клетки микроорганизмов прикрепляются (иммобилизуются) на каких-либо инертных носителях. Питательная среда постоянно поступает в систему и выводится из нее, т.е. это тоже открытая система.
Для выделения микроорганизмов определенных физиологических групп предложена техника так называемых «накопительных культур». Техника накопительных культур основана на использовании элективных методов культивирования, т.е. создания таких условий выращивания бактерий, которые будут максимально благоприятны для развития микроорганизмов определенной физиологической группы, а другие организмы в этих условиях развиваться не могут или их рост будет незначителен.
Подбирая определенный состав питательной среды и параметры культивирования инокулируют среду смесью, содержащей микроорганизмы, выдерживают некоторое время при оптимальной температуре, рН и аэрации, в результате чего получают обогащенную накопительную культуру. Последовательные пересевы на такую же элективную среду предотвращают рост сопутствующей микрофлоры. О получении накопительной культуры свидетельствуют помутнение среды, получение осадка, пленки, выделение газообразных веществ.
Для роста микроорганизмов существенное значение имеет не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы неодинаковы.
Активная кислотность среды. Активная кислотность среды (рН) имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше растет при рН, близком к 7,0. В случае необходимости рН среды доводят до нужного значения растворами кислот (HCl. H2SO4), щелочей (NaOH, KOH) или солей, имеющих щелочную реакцию (Na2CO3, NaHCO3).
Аэрация. Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки в больших количествах. Значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы принято объединять в группу облигатных анаэробов. Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствии кислорода. Получение энергии у них не связано с использованием молекулярного кислорода, а для некоторых из них кислород токсичен. Такие микроорганизмы называются облигатными анаэробами.
Температура. Интервалы температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируют. У мезофиллов температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 370С, у термофилов он значительно выше - от 38 до 450С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5-100 С. Отклонения температуры культивирования от оптимальной неблагоприятно влияет на развитие микроорганизмов, поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах, где поддерживается постоянная температура.
Свет. Для роста подавляющего большинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые солнечные лучи отрицательно влияют на их развитие. Свет необходим для роста фототрофных микроорганизмов, однако естественное освещение для этих целей используется крайне редко, т.к. его трудно контролировать. Как правило, фототрофы выращивают в люминостатах.
Вода. Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причем вода должна находиться в доступной для клетки форме, т.е. жидкой фазе. Доступность воды в субстрате для роста микроорганизмов выражают величиной активности воды:
(аw): аw=Р/Р0,
где Р – давление пара над раствором, мм рт.ст; Р0 – давление пара чистой водой при данной температуре, мм рт.ст.
Микроорганизмы могут расти на средах, где аw=0,99-0,61.