Тема 7. Фізіологія росту та розмноження бактерій. Культуральні властивості мікроорганізмів.

Запитання для обговорення

1. Поняття періодичної та неперервної культури.

2. Параметри росту бактеріальної культури.

3. Вплив фізичних і хімічних факторів на мікроорганізми. Умови культивування.

Самостійна робота

1. Визначення деяких параметрів росту мікроорганізмів під час періодичного культивування.

2. Наступний етап виділення чистих культур із суміші: вивчення культуральних властивостей окремих видів бактерій.

3. Приготування мазків із різних типів колоній, забарвлення за Грамом, мікроскопія.

4. Пересів вивчених колоній на пробірки зі скошеним агаром для виділення чистої культури.

Методичні вказівки

1. Ріст мікроорганізмів у ході періодичного культивування відбувається в закритих системах, у які всі компоненти вносять на початку процесу й потім не додають. Склад середовища, концентрація біомаси та метаболітів увесь час змінюється в результаті залучення цих компонентів у метаболізм клітин. У процесі культивування спостерігаються чотири головні фази росту: лаг-фаза, лог-фаза, стаціонарна та фаза відмирання. Таким чином, у бактеріальній популяції постійно відбуваються ріст бактерій, їх розмноження та відмирання.

Спостерігаючи за розвитком бактеріальної популяції, звертають увагу перш за все на кількість клітин (біомаса) в одиниці обיєму, їх життєздатність, швидкість росту, час подвоєння біомаси.

Із метою визначення цих показників використовують прямі та непрямі методи. Для визначення біомаси використовують такі прямі методи як підрахунок кількості клітин за допомогою лічильної камери Горєва – Тома, підрахунок на фіксованих пофарбованих мазках за методом Виноградського – Бріда, а також непрямий метод – шляхом підрахунку кількості колоній на мембранному фільтрі. Для цього певний обיєм бактеріальної суспензії пропускають крізь мембранний фільтр, а потім переносять його на поверхню стерильного азаризованого середовища в чашках Петрі або іншими методами.

Визначення кількості життєздатних клітин проводять шляхом посіву бактеріальної суспензії в певних розведеннях на щільні поживні середовища, з подальшим підрахунком колоній.

Наприклад, підрахунку: якщо на чашці виросло 50 колоній у розведенні 1:100, то кількість клітин (а) в 1 мл бактеріальної суспензії буде складати

а=50×100×20 (кл/мл), де 20 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл у разі посіву однієї краплі суспензії (0,05 мл).

Для визначення кількісних характеристик росту: швидкості, питомої швидкості росту, подвоєння біомаси (часу генерації) студенти проводять культивування E. coli в МПБ з 2% глюкози при активній аерації на качалці (220 об/хв) і 37°С. Як посівний матеріал використовують передчасно підготовану культуру E. coli в логарифмічній фазі росту, що дозволяє розпочати культивування культури безпосередньо з лог-фази, виключаючи лаг-фазу. З моменту початку культивування через певний проміжок часу (10 хв) беруть проби бактеріальної суспензії та спостерігають за наростанням кількості клітин за допомогою з вищевказаних методів. Параметри росту обчислюються за формулами:

V = (x₁-x₀)/(t₁-t₁) = dx/dt,

де, V – швидкість росту;

x₀ – початкова кількість клітин;

x₁ – кількість клітин у 1 мл через певний проміжок часу;

μ= 1/х × dx/dt,

де, μ – питома швидкість росту;

х – кількість клітин у 1 мл;

td = ln2/μ = 0,693/μ

де, td – час подвоєння біомаси.

2. Студенти вивчають посіви, зроблені на попередньому занятті. У разі правильно проведеного посіву суміші на перших штрихах буде багато мікробів, що стає результатом розвитку суцільного нальоту, дедалі кількість їх зменшується, виявляються ізольовані колонії.

Колонія – це потомство бактерій, які розмножились із однієї клітини.

Студенти вивчають колонії різного типу, неозброєним оком і за допомогою мікроскопа при малому збільшенні.

За своєю будовою та зовнішнім виглядом колонії дуже різноманітні. Вони можуть бути гладенькими і шершавими, прозорими, безбарвними й пігментованими, сухими й вологими, слизовими тощо. Краї колонії можуть бути рівними, щербатими, хвилястими. Кожний вид мікробів має певний тип колоній, що використовується у діагностиці.

Кожний тип колоній описується за схемою, наприклад:

Колонія	Форма	Розмір (діаметр)	Колір	Поверхня	Краї під малим збіль-шенням	Консистен-ція	Морфо-логія мікро-бів
№1	правильна	2 мм	жовтий	гладень-ка	рівні	м’яка	коки (Гр+)
№2	кругла	3 мм	безбарвна	шершава	хвиляста	крихтопо-дібна	палички (Гр-)

3. Після опису колонії треба мікроскопічно дослідити. Із цією метою з частини помічених колоній (двох типів) роблять мазки, забарвлюють за Грамом і мікроскопують. Якщо за морфологією вони відповідають тим, які були в суміші, залишену частину колонії пересівають на скошений агар для одержання чистих культур.

4. Під час пересіву колоній на скошений агар треба петлею брати культуру тільки із поміченої дослідної колонії, не торкаючись сусідніх. Засіяні пробірки підписують і вміщують у термостат на 24 години при температурі 37°С.

Оформити протокол, у якому чітко описати всю проведену роботу, зробити рисунки. Записати, на який час посіви поставлено в термостат, вказати температурний режим.

Матеріали, обладнання, реактиви

Культури E. coli, яка знаходиться на початку логарифмічної фази росту, мікроскоп МБІ-1, бактеріологічна петля, предметні скельця, пробірки з МПА, фізіологічний розчин, фарби.