- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
1.3.2 Дезинтеграция
Из всех имеющихся средств эффективными для разрушения клеток бактерий (и дрожжей) являются пресс Френча или подобные ему устройства, вибрационные мельницы, ультразвуковые дезинтеграторы, некоторые ручные мельницы и пресс Хьюза. Большинство других устройств предназначено для специальных целей или же эффективно при обработке организмов, которые разрушаются легче, чем бактерии (например, ткани простейших или ткани животных). Наиболее полезный и эффективный химический способ дезинтеграции клеток включает использование литических агентов (таких, как лизоцим или лизоцим в сочетании с хелатобразующими агентами, например ЭДТА), Ниже кратко описаны наиболее подходящие приборы, используемые в настоящее время для разрушения клеток в бактериальной энзимологии.
Способ разрушения клеток выбирают в основном эмпирически в зависимости от вида клеток, нужного объема экстракта, чувствительности фермента(ов) к инактивации или изменению в процессе разрушения и необходимости последующего хранения. Часто это приходится делать методом проб и ошибок.
2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
2.1 Экспериментальные условия
Методы определения метаболической (ферментативной) активности микроорганизмов должны быть по возможности точными, чувствительными, непрерывными, удобными и специфическими для изучаемых реакций. Однако чаще всего выполняются далеко не все эти требования. Поэтому, прежде чем признать метод пригодным для использования, необходимо провести многочисленные контрольные и стандартные тесты.
2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
В большинстве случаев для определения активности ферментов каждого определенного вида микроорганизма нужны специальные условия. Нельзя применять один и тот же метод для изучения ферментов одного типа у различных видов бактерий. От вида к виду могут сильно различаться потребности бактерий в ионах и кофакторах, оптимумы рН и температуры, значения Км, чувствительности к ингибиторам и равновесия реакций. Классический пример такого типа вариаций - бактериальная сукцинатдегидрогеназа: условия определения активности этого фермента настолько варьируют, что авторы часто не указывают состав реакционной смеси.
2.1.2 Подавление активности
Если в неочищенном экстракте ферментативная активность не обнаруживается, это еще не означает, что организм, из которого приготовлен экстракт, не содержит этот фермент. Частичная или полная потеря активности фермента, присущей данному микроорганизму, может произойти во время приготовления экстракта. Внутри клетки фермент защищен от инактивации оксидантами и другими веществами окружающей средой и многочисленными белок-белковыми взаимодействиями, которые нарушаются в результате разрушения клеток. В связи с этим следует отметить, что содержание белка в большинстве клеток превышает 100 мг/мл. Однако чаще всего в анализах in vitro используют разбавленные водные растворы ферментов, так как в этих условиях легче осуществлять контроль в процессе эксперимента.
2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
Определению ферментативной активности могут мешать конкурентные побочные реакции. Концентрации субстратов или образующихся веществ могут настолько сильно меняться в результате таких конкурентных реакций, что точное измерение активности становится невозможным.
Например, активность NADH-оксидазы или аденозинтрифосфатазы в неочищенных экстрактах может быть такой высокой, что определение образования или потребления NADH или АТР соответственно будет вызывать большие трудности. Необходимо либо учитывать побочные реакции путем соответствующего контроля, либо находить способы их подавления или нарушения.