- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
При функционировании lac-оперона Е. coli происходит как репрессивная (отрицательная), так и индуктивная (положительная) генетическая регуляция. Присоединение lac-репрессора (продукта гена i) к сайту оператора предотвращает транскрипцию генов, катализируемую РНК-полимеразой (отрицательная регуляция). Индуцирующий агент (любой из β-галактозидов) модифицирует белок-репрессор таким образом, что он теряет способность связываться с оператором. Однако одного этого недостаточно для инициации процесса транскрипции. Чтобы РНК-полимераза смогла осуществлять свою каталитическую функцию в транскрипции, необходимо присутствие положительного регуляторного элемента - белка - рецептора сАМР (продукта сrр-локуса). Такой модифицированный благодаря связыванию сАМР белок присоединяется к промотору. В результате включается lac-оперон и начинается транскрипция. В отсутствие индуктора (деиндукция) или при уменьшении образования сАМР из-за ингибирования аденилатциклазной активности (катаболитная репрессия) транскрипция предотвращается. Аденилатциклаза - это связанный с мембраной фермент, катализирующий превращение АТР в сАМР и пирофосфат. Этот фермент обычно активен во время роста культуры в различных средах, и поэтому клетки образуют сАМР в достаточном количестве. Однако в присутствии некоторых субстратов, например глюкозы или маннита, активность фермента ингибируется и образование сАМР снижается (это явление называют катаболитной репрессией).
3. Решение расчётных задач
Расчётные задачи выбираются и решаются из числа приведённых в ПРИЛОЖЕНИИ 1
ЗАНЯТИЕ 3
АНАЛИЗ ПУТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕГУЛЯЦИИ ПРОНИЦАЕМОСТИ КЛЕТОК И СКОРОСТИ ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ. РАСЧЁТНЫЕ ЗАДАЧИ.
ВВОДНАЯ ЧАСТЬ
Ферменты существуют не в виде отдельных самостоятельных компонентов, функционирующих независимо и случайно, а в виде ансамблей, отдельные элементы которых взаимосвязаны и выполняют свои функции взаимозависимо в определенной последовательности.
Бактериальную клетку можно в действительности рассматривать как одну большую мультиферментную систему, работе которой присуща определенная гармония. Помня о целостности системы, в практической работе мы, однако, вынуждены иметь дело с отдельными группами реакций, составляющими те или иные пути метаболизма. Путями метаболизма обычно называют последовательность координированных реакций, имеющих биосинтетическое или биоэнергетическое значение, например цепь переносчиков электронов, гликолитический путь или пути биосинтеза аминокислот с разветвленными цепями. Именно изучение таких путей, а не исследование отдельных ферментов способствовало накоплению современных знаний о метаболизме бактерий.
Подробный анализ и оценка имеющихся в настоящее время методик изучения путей метаболизма, регуляции проницаемости клеток и скорости транспортных процессов поможет получить общее представление о методических особенностях данных проблем.
ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Пути метаболизма - это последовательность координированных реакций, имеющих биосинтетическое или биоэнергетическое значение, например цепь переносчиков электронов, гликолитический путь или пути биосинтеза аминокислот с разветвленными цепями.
Проникновение - это пассивный переход растворенного вещества внутрь клетки (поглощение) или из клетки наружу (выделение) путем диффузии, которому может способствовать химическое взаимодействие между растворенным веществом и какой-либо клеточной структурой, например мембраной.
Проникновение растворенного вещества через клеточную мембрану описывается уравнением:
dS/dt = РА(∆С)
где dS/dt - изменение количества растворенного вещества внутри клетки в единицу времени, Р - коэффициент проницаемости (с размерностью расстояние/время), А - площадь мембраны и ∆С - разность концентраций растворенного вещества внутри и вне клетки.
Транспорт - это процесс активного перемещения растворенного вещества в клетку или из клетки, который связан с метаболизмом и в котором могут участвовать энергизованные переносчики.
У бактерий наиболее изучены два класса транспортных систем - фосфотрансферазные и пермеазные системы.
Фосфотрансферазная система встречается главным образом у факультативных анаэробов и предназначена для транспорта сахаров.
Пермеазные системы имеются почти у всех бактерий и предназначены для транспорта аминокислот, сахаров, неорганических ионов и предшественников нуклеиновых кислот.
Обменная диффузия - это обмен внутренних и наружных веществ через клеточную мембрану в соотношении 1:1.
СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНЫХ ВОПРОСОВ