- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
2.2.1 Методика анализа
2.2.1.1 Подготовка клеток
Для изучения скоростей транспорта растворенных веществ нужно иметь возможность быстро отделять клетки от среды, в которой они суспендированы. Обычно это делают путем фильтрации через мембранные фильтры, поэтому лучше использовать разбавленные суспензии. Для фильтрации проб объемом 1 мл через фильтр диаметром 25 мм обычно приходится готовить клеточную суспензию, содержащую менее 200 мкг сухого вещества в 1 мл.
2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
Клеточную суспензию и раствор испытуемого вещества доводят отдельно до температуры, выбранной для эксперимента, а затем смешивают, отмечая этот момент как нулевое время. Обычно смешивать надо быстро, так как большинство транспортных процессов протекает с высокой скоростью. Реакционную смесь инкубируют, как правило, недолго (например, 10 мин).
2.2.1.3 Отбор проб и разделение
Пробы реакционной смеси отбирают через короткие интервалы времени (например, 1 мин). Клетки и испытуемый раствор быстро разделяют, обычно путем фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, предварительно смоченный промывным или испытуемым раствором. Можно использовать фильтры и с меньшим размером пор, но они оказывают большее сопротивление потоку жидкости и замедляют процесс фильтрации. Фильтры с размером пор 0,45 мкм пригодны для отделения большинства микробных клеток. Обычно используют ацетатцеллюлозные и нитратцеллюлозные фильтры, особенно если планируется сцинтилляционный счет радиоактивности. В некоторых случаях можно отделять клетки центрифугированием, даже если требуются кинетические данные. Такая процедура дает хорошие результаты чаще с грамположительными, чем с грамотрицательными бактериями.
В некоторых случаях нет необходимости отделять клетки от раствора. Например, ионселективные электроды позволяют вести непрерывное наблюдение за рН, парциальным давлением кислорода (рО2), содержанием ионов калия и т. п. Более того, при изучении поглощения солей часто достаточно бывает лишь следить за изменением проводимости суспендирующей среды с помощью обычной кондуктометрической ячейки.
2.2.1.4 Отмывка клеток
Клетки, остающиеся на фильтре, обычно необходимо промыть для удаления компонентов среды с их поверхности. Промывная жидкость должна быть осмотически забуференной, особенно для грамотрицательных бактерий, так как транспортные системы чувствительны к осмотическому давлению. Для промывания часто используются концентрированные растворы сахаров (например, 0,5 М раствор сахарозы). Можно также добавлять ионы марганца (обычно 50 мМ) в виде хлорида или сульфата. Идеальный промывной раствор должен в основном удалять исследуемое вещество из осадка клеток и фильтра при первом же промывании. Однако обычно приходится идти на определенный компромисс.
Иногда можно избежать необходимости промывания клеток, центрифугируя их через слой жидких силиконов. Клетки проходят через силикон и образуют осадок, не содержащий меж клеточной воды. Немного воды может остаться на поверхности клеток, и вода клеточных стенок также не удаляется.