0,01Н і 2н розчини соляної кислоти; стандарт – кристалічний солянокислий хлортетрациклін; індикатор тимолблау.

Біологічні методи визначення кількості антибіотиків

Активність антибіотиків визначають шляхом порівняння ступеня пригнічення росту чутливих мікроорганізмів у результаті дії випробовуваного антибіотика та стандартного зразка у відомих концентраціях.

Стандартні зразки для кількісного визначення є речовинами з точно встановленою концентрацією відповідно до міжнародного стандартного препарату.

Метод дифузії. Живильне середовище, рекомендоване для кількісного визначення, розплавляють і вносять в нього при відповідній температурі, наприклад, від 48 до 50С для вегетативних форм, певну кількість суспензії мікроорганізмів, чутливих до даного антибіотика. Кількість суспензії має бути такою, щоб забезпечувати чіткі, підхожого діаметру зони пригнічення росту тест-мікроорганізму для всіх концентрацій антибіотика, використовуваних при кількісному визначенні. Негайно після внесення мікроорганізмів живильне середовище розливають у чашки Петрі Допускається розливати середовище у два шари, з яких інокульовано лише верхній шар.

Готують розчини стандартного зразка антибіотика з відомими концентраціями і розчини випробовуваного антибіотика, передбачувані концентрації якого не мають істотних відмінностей від концентрацій стандартного зразка. Розчини наносять на поверхню середовища, використовуючи стерильні циліндри з фарфору, нержавіючої сталі або іншого матеріалу, або вносять розчини в лунки, підготовлені в твердому середовищі. У всі циліндри або лунки вносять рівні об’єми розчинів. Досліди необхідно ставити щонайменше у триразовій повторності.

Чашки інкубують при відповідній температурі близько 18 год. Вимірюють діаметри круглих зон затримки росту з точністю 0,1 мм і розраховують активність.

Турбідиметричний метод. У відповідне поживне середовище вносять суспензію вибраних мікроорганізмів, чутливість яких до випробовуваного антибіотика така, що забезпечує достатньо сильне пригнічення їх росту за умов проведення випробування. Використовують певну кількість суспензії, яка підбирається таким чином, щоб одержати легко вимірювану каламутність після закінчення інкубаційного періоду тривалістю близько 4 год.

Готують розчини стандартного зразка з відомими концентраціями і розчини випробовуваного антибіотика. Всі досліди проводять у трикратній повторності. Рівні об ’єми кожного з розчинів вносять в однакові пробірки і додають у кожну пробірку рівні об ’єми інокульованого середовища (наприклад, 1 мл розчину і 9 мл середовища). Паралельно готують дві контрольні пробірки з інокульованим середовищем, що не містить антибіотика. В одну з них одразу вносять 0,5 мл формальдегіду. Ці пробірки використовують для настроювання

оптичного приладу, за допомогою якого проводять вимірювання. Усі пробірки розташовують у водяній бані або інший пристрій, що дозволяє швидко довести пробірки до необхідної температури інкубації. Пробірки витримують при цій температурі від 3 до 4 год., забезпечуючи однорідність температури і рівний час інкубації для кожної пробірки.

Після закінчення періоду інкубації зупиняють ріст мікроорганізмів, додаючи в кожну з пробірок 0,5 мл формальдегіду, або шляхом теплової обробки і за допомогою оптичного приладу вимірюють каламутність вмісту пробірок. Розраховують активність, використовуючи відповідні статистичні методи.

Таблиця 1.1. Поживні середовища і тест-культури, що використовуються для мікробіологічного визначення концентрації антибіотиків

Антибіотик	Склад середовища					Тест-культура	та	її
						засівна доза
Пеніциліни	“Голодний” агар – агар-агар					S. aureus 209P (40*106
	+ 0,3% Na2HPO4 (pH				6,8 –	мікробних клітин в 1мл
	7,0)					середовища)
	Поживний		агар	–	1%
	голодний агар + 130 мг%
	амінного	азоту		+	0,1%
	глюкоза (рН 6,8 – 7,0)
Цефалоспорини	“Голодний” агар – агар-агар					B. subtilis ATCC 6633 (40*106
	+ 0,3% Na2HPO4 (pH				6,8 –	мікробних клітин в 1мл
	7,0)					середовища)
	Поживний		агар	–	1%
	голодний агар + 130 мг%
	амінного	азоту		+	0,1%
	глюкоза (рН 6,8 – 7,0)
Макроліди	Використовується					M. luteus ATCC 934 (10*106
	одношаровий		агар	–	1,5%	мікробних клітин в 1мл
	агар Хоттингера, збагачений					середовища)
	30 – 35 мг% амінного азоту
	(рН 7,8 – 8,0)
Аміноглікозиди	“Голодний” агар – агар-агар					B.subtilisATCC		6633
	+ Na2HPO4 (pH 6,8 – 7,0)					(100*106 мікробних клітин в
						1мл середовища)
	Поживний агар – 1,5%				агар
	Хоттингера + 130 мг%
	амінного	азоту		+	0,1%
	глюкоза (рН 7,8 – 8,0)
Ріфампіцин	Використовується					M. luteus NCTC (200*106
	одношаровий		агар	–	1,5%	мікробних клітин в 1мл
	агар Хоттингера			+	2,5%	середовища)
	К2HPO4 + 130 мг% амінного
	азоту + 0,1% глюкоза (рН 6,0
	– 6,2)