Гемоглобін

3.5.5. Виділення гемоглобіну.

Гемоглобін виділяли за методикою Драбкіна [18].

Обладнання та матеріали: цільна периферична кров, центрифуга, піпетки, центрифужні пробірки, скляні пробірки, штатив .

Реактиви: 1. Толуол,

2. Дистильована вода.

3. 0,150 М (0,9 %) NaCl.

Гемоглобін, отримують з еритроцитів гепаринізованої периферичної крові людини чи тварини. Еритроцити відділяють від плазми центрифугуванням протягом 10 хвилин при 3000 об/хв (500 g). Плазму відбирають піпеткою і використовують для подальших досліджень. Еритроцитарну масу відмивають від білків плазми крові охолодженим ізотонічним розчином NaCl (0,150 М). До еритроцитарної маси у пробірки додають 4 – 5 об’ємів охолодженого ізотонічного розчину, обережно перемішують і центрифугують 10 хвилин при 3000 об/хв. Процедуру повторюють 5 раз.

До промитих еритроцитів додавали дистильовану воду та толуол в співвідношенні 1:1,5:1. Суміш добре перемішували на протязі 15 хвилин, поміщали на декілька годин в холодильник для остаточного проходження гемолізу. Центрифугували протягом 15 хв при 8000 об/хв (3500 g). для відділення строми. Отриманий гемолізат обережно відбирали пастерівською піпеткою, або шприцом, фільтрували і використовували для подальших досліджень.

3.5.6. Визначення концентрації гемоглобіну

Невелику кількість гемоглобіну переводили в ціанметформу для визначення концентрації. Концентрацію гемоглобіну визначали за методикою Кушаковського [11].

Обладнання, матеріали і реактиви.

1. Спектрофотометр, кювети, пробірки, штатив, піпетки.

2. Розчин оксигемоглобіну.

3. Дистильована вода.

4. 10 %-ний розчин K₃Fe(CN)_6.

5. 10 %-ний розчин ацетонціангідрину.

Хід роботи.

У пробірку вносять 0,1 мл розчину гемоглобіну, додають 4,8 мл води і 0,05 мл 10 %-ного розчину K₃Fe(CN)_6.. Спостерігається зміна забарвлення розчину від червоного до коричневого, що свідчить про перехід оксигемоглобіну у метгемоглобін. Через 5 хв. додають 0,05 мл 10 %-ного розчину ацетонціангідрину. Розчин стає яскраво червоним. Метгемоглобін мерейшов у ціанметгемоглобін, для якого характерна широка смуга у видимій ділянці спектру поглинання з максимумом при 540 нм. Використовуючи мілімолярний коефіцієнт поглинання при цій довжині хвилі вираховують концентрацію гемоглобіну за формулою:

С_мкмоль = (D₅₄₀ / · d) · n = (D₅₄₀ / 11,51· d) · n - з розрахунку на мономер.

С_мг/мл = [(D₅₄₀ · 60 000 / (11,51 × 4) · d ]· n - розрахунок на тетрамер,

звідси - С_мг/мл = D₅₄₀ · 1,47 · n , де

D₅₄₀ - оптична густина розчину гемоглобіну;

ε – мілімолярний коефіцієнт поглинання ціанметгемоглобіну при 540 нм (11,51 млмоль^-1 см^-1);

1,47 – коефіцієнт перерахунку молекулярної маси гемоглобіну (тетрамер) на мілімолярний коефіцієнт поглинання;

d – товщина шару розчину у кюветі дорівнює 1 см;

n - розведення.

3.5.7. Визначення пероксидазної активності метгемоглобіну.

Гемоглобін , як і міоглобін, проявляє пероксидазну активність. Важливим є те, що гемоглобіни окремих видів організмів і навіть окремі фракції одного і того ж білка можуть проявляти неодинакову пероксидазну активність. Цей феномен може бути використаним як у наукових дослідженнях так і в медичній практиці.

Хід роботи.

Для роботи використовують гемоглобін , виділений за методом Драбкіна [ ].

Розчин оксигемоглобіну (HbО₂) переводять у метформу (MetHb). До 1 мл розчину HbО₂ (100 мкг/мл) додають 0,01 мл 10 %-ного розчину K₃Fe(CN)₆ .

Реактиви та реакційні суміші готують за схемою, описаною для визначення пероксидазної активності меміоглобіну.

1. Реакційну суміш для визначення пероксидазної активності метгемоглобіну готують за схемою:

MetHb Vмл + (2-V) мл Н₂О + 2 мл буфера + 0,5 мл гваякола

(0,5 MetHb Mb + 0,5 мл Н₂О + 1 мл буфера + 0,25 мл гваякол)

2. Суміш переносять в спектрофотометричну кювету.

3. Як контроль використовують таку ж суміш. Однак, замість гідроген пероксиду вносять ту ж кількість води.

4. В дослідну пробу вносять 0,5 (0,25) мл гідроген пероксиду, швидко перемішують, закривають кювету і проводять спектрофотометрування зразка. Початок реакції відраховують з часу введення Н₂О₂. Спостерігається утворення забарвленого комплексу, кількість якого зростає, пов’язаної з розщепленням Н₂О₂ , вивільненням .

5. За ходом реакції спострерігають по зміні поглинання світла при 440 нм за допомогою спектрофотометра СФ-46 або ФЕК.

Величину Т (пропускання), або Д (поглинання) проводять через кожні 30 с.

Краще перевести значення Т в значення Д (поглинання): Д = 2 – lg Т.

6. Пероксидазну активність визначають за формулою:

А = ΔD· V · 1000/ε · a· c,

де : А – пероксидазна активність MetHb;

ΔD – середнє значення вимірювання оптичної густини проби при довжині хвилі 440 нм;

V - загальний об’єм суміші у кюветі;

1000 – коефіцієнт перерахунку від мікромоля до наномоля;

ε - коефіцієнт мілімолярної екстинкції ( 6,22 ·см^-1мкм^-1);

a – об’єм зразка у кюветі;

c – концентрація гемоглобіну (зразка).

7. Будують кінетичну криву, як функцію Д = f(t) і знаходять початкову швидкість пероксидазної реакції по тангенсу кута прямолінійної кривої в одиницях оптичної густини (швидкість реакції виражають в мкМ/с, використовуючи множинник 11,23, одержаний калібруванням за допомогою окисної системи Ag⁺ -S₂O₈^2--).

Висновки. Звіт.

Література ?