3.5.4. Автоокислення оксиміоглобіну.

І. Автоокислення оксиміоглобіну. Автоокиснення є одним з показників структурно-функціонального стану міоглобіну і гемоглобіну. І міоглобін і гемоглобін можуть спонтанно окилюватися. У цьому плані міоглобін легше ніж гемоглобін піддається окисненню завдяки мономерній організації цьогогемопротеїну. Окиснення міоглобіну спряжено з переходом заліза гему з двохвалентного у трьохвалентне і втратою здатності зворотньо зв’язувати кисень. В умовах дефіциту оксигену оксиміоглобін може окислюватися за рахунок кисню, звязаного з гемовим залізом.

Автоокислення. Одним з показників структурно-функціонального стану Mb є його стійкість до спонтанного окислення. Окислення Mb спряжено з переходом його в неактивний стан з тривалентним залізом гема, не здатного до зворотнього зв'язування кисню.

В умовах припинення доступу кисню із зовнішнього середовища окси-Mb здатний до автоокислення за рахунок кисню, зв'язаного з гемовим залізом.

k₁

Mb²⁺ + О₂  Mb²⁺ + О₂

k₂

k₃

Н⁺ + Mb²⁺ + 1/4О2  Mb³⁺ + 1/2Н₂О.

Окиснення проходить по реакції першого порядку. Експериментальні константи (k) швидкості окислення Mb показують, що інтенсивність реакції пропорційна концентрації Оксигену.

В літературі активно обговорюються наступні аспекти запропонованого механізму: 1) Оксиген може дисоціювати від заліза гему і потім окислювати його в дезокси-Mb з утворенням мет-форми. При цьому Оксиген переходить в О₂^- і утворюється комплекс Mb⁺Lg^- , де Lg^{- --} ліганд-аніон, що акцептує електрон з гему. Супероксидний аніон О₂^- в результаті спонтанної дисмутації перетворюється в Н₂О₂ , яка є потенційним окислювачем Mb. Кінетичний аналіз показав, що лімітуючим фактором автоокислення оксиміоглобіну є заміщення ліганду О₂^- молекулою води чи гідроксилом. Роль протонного каталізатора автоокислення відіграє дистальний гістидин. Можливим аніоном в цьому випадку може бути хлор, який, зв'язуючись з дезоксиформою, забезпечує опосередкований перенос електронів від заліза (2⁺) на вільний Оксиген. Оксиміоглобін може дисоціювати безпосередньо утворюючи мет форму і супероксиданіон.

У роботі використовується хроматографічно чистий препарат міоглобіну (MbO₂) попередньо очищений від солей і деоксигенований за допомогою відновлення дітіонітом натрію з наступною оксигенацією в процесі гель-фільтрації.

Обладнання: Дві колонки розміром 1,230 см, упакованих сефадексом G-25 (середній); спектрофотометр СФ-46, ФЕК- .

Реактиви:

1. Препарат міоглобіну.

2. Ферріціанід калію (K₃Fe(CN)_6.).

3. 0,01 М KCl, рН 7.0.

4. 0,1м Тріс- НCl буфер, рН 7.2.

5. 1мМ ЕДТО.

6. Дітіоніт натрію (Na₂S₂O₄).

Хід роботи:

Приготування оксиміоглобіну. 1. Препарат міоглобіну переводять в метформу за допомогою ферріціаніду калію, додаючи його в невеликій кількості до концентрованого розчину міоглобіну. Через 5 хв. розчин відцентрифуговують на протязі 10 хв. при 15000 об/хв. або фільтрують.

2. Надлишок K₃Fe(CN)₆ удаляють гель-фільтрацією на колонці з G-25.

3. До отриманого препарату метміоглобіну додають невелику кількість Na₂S₂O₄ і безпосередньо піддають гельфільтрації через колонку з G-25, що попередньо врівноважена 0, 1 М KCl, рН 7,0. У процесі гельфільтрації, по мірі очистки від надлишку дітіоніту натрію, відбувається оксигенація міоглобіну.

Приготування інкубаційної суміші. Хід визначення.

1. У пробірку, що містить 5 мл тріс- НCl буфер, рН 7.2, 0.1М та 1мМ ЕДТО попередньо відфільтрованого на стерильних нітроцеллюльозних фільтрах, додають таку кількість MbO₂, щоб оптична густина розчину при 580 нм дорівнювала 1,0 (співвідношення при 580/542 нм для MbO₂ = 1,6 – 1,8 ).

2. Перенести в стерильні кювети від ФЕКу одержані розчини, закрити кювети кришками, не допускаючи утворення пухирців. Запаяти за допомогою розплавленого парафіну. Для запобігання контакту розчину у кюветі з повітрям можна обережно наслоїти на нього тонкий шар олії.

3. На саморегулюючому спектрофотометрі провести регістрацію спектра поглинання досліджуваного оксиміоглобіну у видимій ділянці спектру (400-600 нм). У випадку відсутності саморегулюючого спектрофотометра визначають оптичну густину розчину на звичайному спектрофотометрі при 580 нм (для MbO₂), або при 630нм чи 505 нм (характеристичні максимуми для. Поміщають кювету в термостат на 37С. Регістрацію змін спектральних характеристик оксиміоглобіну здійснюють через кожні 20 хв.

Форма звіту: Використовуючи одержані дані, побудувати графік залежності інтенсивності накопичення метміоглобіну від часу від часу інкубації розчину MbO₂ за низьких значень рО₂ в системі півлогарифмічних координат.

Враховуючи, що автоокислення MbO₂ є реакцією першого порядку розрахувати константу швидкості автоокислення досліджуваного міоглобіну.