Оптимізація способу визначення карбоксигемоглобіну в крові людей

Львівський університет

Найважливішим механізмом токсичної дії СО є лігандування з гемопротеїдами, і, в першу чергу, з гемоглобіном. Взаємодія оксиду вуглецю з гемоглобіном крові призводить до утворення карбоксигемоглобіну (СО-Нв), наслідком цього є зниження киснезв`язуючої здатності крові, причиною високої конкурентно здатності оксиду вуглецю відносно кисню є його висока спорідненість до дезоксигемоглобіну, яка перевищує в 250 – 300 разів спорідненість до даного дихального білка кисню [3, 5, 6]. Таким чином при підвищеній концентрації оксиду вуглецю в середовищі утворюється патологічний комплекс СО-Нв, що веде до немічного типу кисневої недостатності. Надходження кисню до клітин тканин при цьому значно знижується.

В останнє десятиліття багатьма дослідженнями встановлено, що одним із джерел оксиду вуглецю є повітря, яке людина видихає. Цей, ендогенного походження оксид вуглецю, утворюється при метаболізмі гемвмісних білків. У випадку перебування людини в герметизованих приміщеннях накопичується оксид вуглецю, який стає причиною аутоинтоксикації.[5].

Діагностика, лікування і профілактика отруєнь чадним газом потребують розробки експресивних і надійних методів визначення СО-Нв у крові людини. Одним із перспективних методів є метод спектрофотометричного аналізу комплексу СО-Нв [7]. Цей методичний підхід найбільш підходить для широкого використання, особливо в двохвилевому варіанті аналізу бінарних сумішей гемоглобінів. В цих випадках найчастіше використовують дитионітний метод аналізу карб оксигемоглобіну в різних модифікаціях [3]. Теоретично доведено, що для аналізу двокомпонентних систем достатньо вибрати дві довжини хвилі, одну із яких зручно брати в ізобестичній точці [8].

В наших дослідженнях в якості вихідного матеріалу визначення карб оксигемоглобіну бів обраний дитіонітний метод з використанням двох довжин хвиль – 538 і 550 нм [4].

Ціллю даної роботи було теоретичне обґрунтування і методичне здійснення оптимізації способу визначення карбоксигемоглобіну в цільній крові людей. В результаті вибрані оптимальні параметри процесу гемолізу еритроцитів крові і реакції відновлення гемоглобіну, які дозволяють підвищити простоту, експресивність і точність виконання аналізу на автоматичному фотометрі, створеному для цієї цілі.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Дослідження проводили на очищення гемоглобіну, відмитих від плазми еритроцитах і цільної крові. Гемоглобін із еритроцитів крові людини отримували по методу Драбкина [9]. Концентрацію гемоглобіну визначали в ціанометформі [7].

, де

Д – оптична густина розчину гемоглобіну при 540 нм; 100 – розведення, 10,99 - мілімолярний коефіцієнт екстинції (в розрахунку на 1 гем), ціанметгемоглобіну при 540 нм [7]; 4 - коефіцієнт перерахунку від 1 гема на тетраметр.

Спектрофотометричні виміри проводили на приборах СФ-26 і "Спекорд" (ГДР).

Оксигемоглобін; до 0,1 мл 1 мМ розчину гемоглобіну, додатково оксигенованого чистим О₂ і перевіреного на відсутність метформии по Родки і О`Нилу [10], додавали 4,9 мл відповідного буферу і проводили спектрофотометрування протии буфера.

Отриманий розчин гемоглобіну слугував також вихідним для приготування дезокси- і карбоксиформ.

Дезоксигемоглобін отримували додаванням до 5 мл розчину НвО₂ 3-5 мг сухого дитіоніту натрія. Через 2-3 хвилини проводили спектрофотометри чні виміри.

Карбоксигемоглобін готували пропускаючи СО через розчин оксигемоглобіну протягом 15-20 хв.

Калібрувальні досліди. Для визначення кількісного вмісту карбоксигемоглобіну в суміші з дезоксигемоглобіном будували калібрувальні графіки. В якості вихідних розчинів використовували 10 мкМ-ні оксигемоглобін і карбоксигемоглобін в 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,3. Модельні суміші з вмістом СО-Нв від 10 до 100% отримували з допомогою двох послідовно розміщених по ходу променя 1 см-кювет, помістивши в кожну відповідну форму гемоглобіну при концентраціях, вказаних в табл. 1.

В проби з 5 мл оксигемоглобіну безпосередньо перед спектрофотометруванням вносили 8 мг відновлюючої суміші А (див. нижче) для отримання дезоксиформи (оптичну густину «сумішей» вимірювали при 538 і 550 нм через 2-3 хв після додавання відновлювача проти води, яка також внесена у дві кювети.

Таблиця 1

Дані калібрувальних дослідів визначення СО-Нв в «суміші» з нВ (спектрофотометр СФ-26)

№ п/п	% СО-Нв	СО-Нв (с=10 мкМ) мл	3 мМ фосфатний буфер, рН 7,36 мл	Нв (с=10 мкМ) мл	3 мМ фосфатний буфер, рН 7,36 мл	% Нв	Д538	Д550	Д538/Д550
1	90	4,5	0,5	0,5	4,5	10	0,536	0,461	1,16
2	80	4,0	1,0	1,0	4,0	20	0,520	0,462	1,12
3	70	3,5	1,5	1,5	3,5	30	0,502	0,462	1,09
4	60	3,0	2,0	2,0	3,0	40	0,497	0,481	1,01
5	50	2,5	2,5	2,5	2,5	50	0,476	0,485	0,98
6	40	2,0	3,0	3,0	2,0	60	0,472	0,485	0,96
7	30	1,5	3,5	3,5	1,5	70	0,450	0,485	0,92
8	20	1,0	4,0	4,0	1,0	80	0,436	0,502	0,87
9	10	0,5	4,5	4,5	0,5	90	0,425	0,508	0,84
10	0	0	5,0	5,0	0	100	0,415	0,517	0,80

Калібрувальні досліди повторювали три рази. По середніх значеннях оптичних густин визначали відношення Д₅₃₈/Д₅₅₀ і будували калібрувальний графік залежності цього параметра від відсоткового вмісту СО-Нв (табл. 1, рис. 1). На основі параметрів отриманої калібрувальної прямої виведена аналітична формула для розрахунку відсоткового вмісту СО-Нв в суміші.

(1)

Кінетику гемолізу еритроцитів крові розчинами різного складу досліджували наступним чином. До 3 мл розчину, який досліджували на гемолітичну активність (в кюветі) додавали 20 мкл еритромаси. Суміш швидко перемішували і через 30 с знімали залежність густини розчину при 630 нм від часу, на СФ-26, якмй оснащений самописцем Н-39. Контролем слугувала вода.

Визначення вмісту карбоксигемоглобіну в цільній крові людей. Для аналізів використовували периферичну кров (20-30 мкл), взяту із пальця за допомогою скляного капіляра попередньо промитого розчином гепарину (50000 од/мл). для відновлення гемоглобіну використовували сухі суміші дитіоніту натрію з компонентами а, К-фосфатного або боратного буферу. Розрахунок кількості компонентів проводився з урахуванням кінцевої концентрації буферу 3-5мм і рН 7,36 (для фосфатного) і рН 9,18 (для боратного) і вмісту дитіоніту на 1 пробу об`ємом 3 мл - 4 мг.

Склад сумішей

Суміш А: а₂НРО₄ ▪ 12Н₂О – 0,2602 г; КН₂РО₄ – 0,0236 г; а_{2 2}О₄ – 0,4000 г.

Суміш Б: а₂В₄О₇ ▪ 10Н₂О – 0,3432 г; а_{2 2}О₄ – 0,4000 г.

Для дозування кількості внесеної відновлюючої суміші використовували ложечку – дозатор, яка відбирає -8 ± 1 мг суміші А і 11 ± 1,5 мг – для суміші Б.

У 1 см кювету з 3 мл Н₂О вносили 20-30 мкл гепаринізованої крові, закривали кришкою, вміст перемішували. Через 1-2 хв до розчину додавали відновлюючу суміш, перемішували. Оптичну густину розчину вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при 536 і 550 нм. Розрахунок СО-Нв проводили за формулою (1).

У серійних визначеннях використовували набір пробірок, які містили по 3 мл води, в які вносили по 20-30 мкл гепаринізованої свіжої крові. Суміш перемішували. Після закінчення серій взяття крові у кількох людей в кожну пробу безпосередньо перед спектрофотометруванням вносили відновну суміш і через 1 хв проводили вимірювання.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У зв'язку з тим, що в якості початкового способу визначення карбоксигемоглобіну нами застосований дитіонітний метод [4], було проведено дослідження оптимальних параметрів реакції відновлення HвO₂ до Нв. На підставі порівняльних спектрофотометричних досліджень встановлено, що повне переведення НвО₂ в Нв і сталість спектральних характеристик останнього спостерігається в широкому діапазоні молярності (3,3 - 100 мМ) і рН (6,0 - 9,18) двох досліджуваних буферів - фосфатного і боратного Для повного відновлення 5 мл 20 мкМ гемоглобіну потрібно З-5 мг дитіоніту натрію. Карбиксигемоглобін в діапазоні вказаних параметрів системи також зберігає сталість своїх спектральних властивостей.

Одним з важливих умов виконання аналізу лігандних форм гемоглобіну в цільній крові є забезпечення повного гемолізу еритроцитів. У зв'язку з цим була досліджена гемолізуюча здатність води, деяких буферів, а також детергентів – сапонінів і тритон Х-100. На рис. 2 представлена кінетика гемолізу еритроцитів людини водою, 3,3 мМ фосфатним буфером і різними концентраціями сапоніну (від 0,01 до 0,16 мг/мл). Виявилося, що вода гемолізує еритроцити приблизно за 4-5 хв, 3 мМ фосфатний буфер, рН 7,36 руйнує еритроцити приблизно через 1 хв, причому оптична густина отриманого гемолізату при 630 нм істотно нижча, ніж для водного гемолізату, що свідчить про кращу розчинності строми в буфері, ніж просто в Н₂О. Гемолізуюча здатність сапоніну з підвищенням концентрації збільшується від 5 хв при С = 0,01 мг/мл до приблизно 0,5 хв при С = 0,16 мг/мл. Однак застосування сапоніну з концентрацією більше 0,06 мг/мл призводить до збільшення поглинання при 630 нм, що пов'язано, мабуть, з помітним помутнінням розчину. Причина цього явища не зрозуміла. Можливо, при більших концентраціях сапоніну спостерігається денатурація білка, як це відмічено для впливу додецилсульфату натрію на гемоглобін [1].

На рис.3 показано кінетику гемолізу еритроцитів фосфатним і боратним буферами (рН 7,36 і 9,18 відповідно) з різною молярністю - 3,3-100 мМ. Фосфатний буфер стабілізує еритроцити починаючи з концентрації 0,1 М, а боратний - з 2 мМ. Оптимальними концентраціями для забезпечення гемолізу є 3-10 мМ для фосфатного і 3-5 мМ для боратного буферу, причому швидкість гемолізу в таких умовах вища, ніж в H₂O. Крім того остаточна оптична густина гемолізату в таких буферах нижча, ніж в H₂О, що пов'язано, судячи з усього, з кращою строморозчиняючою здатністю буферів, ніж води.

На рис.4 представлені результати вивчення гемолізуючої здатності водних розчинів тритон Х-100 при різних концентраціях цього детергенту. Показано, що детергент гемолізує еритроцити дуже швидко (1 хв) в діапазоні концентрацій: 0,1-1,0%, забезпечуючи при цьому велику стромо розчинну здатність, ніж вода. Встановлено також, що присутність тритон Х-100 у встановлених концентраціях не впливає на спектральні характеристики дезоксигемоглобіну. Таким чином, з точки зору забезпечення повного і швидкого гемолізу еритроцитів і кращого розчинення компонентів строми найбільш оптимальними виявились фосфатний і боратний буфери (рН 7,36і і 9,18) з молярністю 3-5 мМ, а також тритон Х-100 при концентрації 0,1-1,0%. Для подальших аналізів СО-Нв в цільній крові нами використані відновлювальні суміші на основі двох буферів – фосфатного і боратного, які дають практично однакові результати (див. таблицю 2). Були проведені одиничні і серійні визначення карбоксигемоглобіну в цільній крові людей (див. розділ "матеріали і методи»).

Ці два підходи дають аналогічні результати. Серійний варіант проведення аналізів має ту перевагу, що одночасно можна взяти кров на дослідження у багатьох людей і створюються оптимальні умови гемолізу еритроцитів.

Таблиця 2

Вміст карбоксигемоглобіну в цільній крові людей

№ п/п	суб	Боратний буфер		Фосфатний буфер		Загальне середнє % СО-Нв
			% СО-Нв		% СО-Нв
			М+		М+
1	А	3	1,03 ± 0,55			1,30 ± 0,55
2	Б	3	3,38 ± 0,82	3	2,45 ± 0,79	2,91 ± 0,47
3	В	2	2,98 ± 0			2,98 ± 0
4	Г	3	6,27 ± 0,90	3	5,35 ± 2,58	5,81 ± 0,46
5	Д	3	4,02 ± 0,35	3	3,13 ± 0,38	3,57 ± 0,44
6	Е	3	3,75 ± 0,67	2	3,91 ± 0,09	3,83 ± 0,08
7	Ж	3	5,91 ± 0,65	3	7,23 ± 0,71	6,57 ± 0,66
8	З	2	2,69 ± 1,37			2,69 ± 1,37
9	И	2	1,03 ± 0,49	2	0,80 ± 0	0,91 ± 0,11

Точність аналізу карбоксигемоглобіну залежить у великій мірі і від похибки шкали використовуваного спектрофотометра (СФ-26). Так, похибки при вимірах оптичної густини на 0,010-0,005 одиниць призводять до похибки у визначенні вмісту СО-Нв - на 3%.

Слід зазначити, що дуже важливим елементом, що забезпечує точність результатів, є недопущення утворення фібрину, яке веде до появи каламуті в розчині. Для цієї мети капіляр для забору крові повинен бути попередньо промитий гепарином. Крім того, не рекомендується брати більше трьох проб крові з одного проколу пальця оскільки в протилежному випадку ймовірність утворення фібрину підвищується. Для більшої надійності визначення рекомендується проводити два-три паралельних аналізи. Зазначені складності не зустрічаються при аналізі СО-Нв в гепаринізованій крові, взятої з вени.

З метою практичного застосування оптимізованої нами методики було проведено аналіз карбоксигемоглобіну в цільній крові здорових людей (табл. 2). Позначилося, що вміст СО-Нв в крові коливається в межах 0,9-6,6%. Із літератури відомо, що у здорових некурящих людей карбоксигемоглобін виявляється в кількостях від 0,25 до 2,1% загального гемоглобіну. У курящих ці величини можуть зростати до 6,6% [3]. Забруднення повітря в міській місцевості підвищує вміст СО-Нв в крові до 2-4%, причому у курців до 2-4%, а в деяких випадках і до 16% [8].

Таким чином, отримані нами результати з урахуванням помилки визначення знаходяться у відповідності з літературними даними. Відповідно, модифікація відомого способу визначення С0-Нв [4], який полягає у спрощенні процедури аналізу – застосування в якості реактивів тільки води і сухого реагенту, який поєднує функції буферної системи і відновника і не перешкоджає гемолізу еритроцитів, дозволяє добитися достатньої точності і відтворюваності результатів аналізу при кращій його пристосованості для виконання на автоматичному фотометрі.

ЛІТЕРАТУРА

1. Артюхов В.Г., Шмельов В.П. Український біохімічний журнал. 1977 т.49, »2, с.12-15

2. Доіс видання. Кількісні проблеми біохімії. М:. Світ, 1983.

3. Кушаковський М.С. Клінічні форми пошкодження гемоглобіну .- Л. Медицина 1968 року.

4. Методичні вказівки про кількісний визначенні карбоксігемо глобіну і карбоксимиоглобина. М:. МОЗ СРСР, 1974.

5. Сксенгендлер Г.І. Отрути і протівоядія.Л. Наука, 1982.

6. Тиунов Л.А., Кустов В.В. Токсикологія окису вуглецю. М:. Міді ¬ цина, 1980.

86