- •3.5. Практична частина методи дослідження структурно-функціональних властивостей міоглобіну.
- •3.5.1. Виділення міоглобіну з скелетного м’яза.
- •Хід роботи:
- •Очистка міоглобіну від сірчанокислого амонію і низькомолекулярних сполук методом гель-хроматографії.
- •3.5.3. Визначення пероксидазної активності метміоглобіну .
- •Хід роботи.
- •Хід визначення:
- •3.5.4. Автоокислення оксиміоглобіну.
- •Хід роботи:
- •Дослідження гетерогенності міоглобіну.
- •Хід роботи:
- •3.5.2. Дослідження гетерогенності міоглобіну.Методом диск-електрофорезу в поліакриамідному гелі
- •3. Диск-електрофорез.
- •Гемоглобін
- •3.5.5. Виділення гемоглобіну.
- •3.5.6. Визначення концентрації гемоглобіну
- •3.5.7. Визначення пероксидазної активності метгемоглобіну.
- •3.5.7. Автоокислення оксигемоглобіну.
- •Хід роботи:
- •Визначення спорідненості гемоглобну до кисню за методикою Іванова
- •Хроматографія білків на км-целюльозі.
- •Хід роботи:
- •Диск-електрофорез
- •Хід роботи:
- •3.2. Практична частина
- •3.2.1. Розділення білкової суміші методом гель-фільтрації
- •Дослідження гетерогенності міоглобіну.
- •3. Диск-електрофорез.
- •Хід роботи:
- •Фракціонування на іоннообмінниках.
- •Хід роботи:
- •Диск-електрофорез.
- •Хід роботи:
- •3.2.2. Фракціонування білків
- •3.2.4. Електрофорез білків сироватки крові на папері
- •3.2.5. Електрофорез білків в агаровому гелі
- •3.3. Принципи колонкової хроматографії
- •Оптимізація способу визначення карбоксигемоглобіну в крові людей
Хід роботи:
1. Замороженні м’язи, очищені від жиру та сполучної тканини, пропускають через м’ясорубку. Одержаний фарш заливають 2-х кратним об’ємом дистильованої води (краще на 100 г фаршу 150 г води) та залишають для екстракції на ніч в холодильнику, запобігаючи заморожуванню розчину.
2. Після 10-12-ти годинної екстракції грубі частинки подріблених м’язів відділяють від екстракту, проціджуючи суміш крізь подвійний шар марлі. Вимірюють об’єм фільтрату. До одержаного розчину додають сірчанокислий амоній до 50%-го насичення. Можна також проводити екстракцію безпосередньо в 50%-му розчині сірчанокислого амонію, доведеного безпосередньо розчином NaOH (20%) до величини рН 7,0.
3. При висолюванні супутних білків з м’язевого екстракту сірчанокислий амоній слід додають невеликими порціями, поволі розмішуючи до повного розчиненнясолі. Не допускати утворення піни, оскільки часто міоглобін денатурує на поверхні розділу двох фаз. Після доведення насичення сульфатом амонію до 50%, рН доводять до 7,0 шляхом додавання невеликої кількості 20% розчину NaOH. Щоб запобігти локальній денатурації білку в точці додавання NaOH слід обережно додавати їдкий натрій одночасно перемішуючи розчин скляною паличкою.
4. 50%-ний розчин залишають в холодильнику на 30 хв. Потім проводять фільтрування через паперовий складчатий фільтр. Вимірюють об’єм фільтрату.
5. До фільтрату знову додають сірчанокислий амоній з розрахунку насичення до 80%, враховуючи остаточний об’єм, користуючись формулами 3.5.а, 3.5.б і таблицею розчинності сірчанокислого амонію (табл. Х). Знову доводять рН до 7,0, як описано вище. Через годину відфільтровують осад крізь паперовий фільтр. На фільтрі залишається білки, які осіли при 80 %-ному насиченні екстракту сульфатом амонію. Знову вимірюють об’єм фільтрату.
6. До одержаного фільтрату додають сірчанокислий амоній з розрахунку 100%-ного насичення (табл. Х). і залишають на холоді.
7. Через декілька годин осад відфільтровують крізь паперовий фільтр. “Пасту”, що осідає на фільтрі, збирають в посуд, що щільно закривається і виготовленний з хімічно інетного матеріалу. Пасту зберігати про 0-4С.
Мілімолярний коефіцієнт міоглобіну складає 10,76 при 505 нм, молекулярна маса 17000. Для більш швидкого виділення міоглобіну можна вести висолювання після 80%-го насичення (75%-го для щурів), додаючи невеликі порції солі, при появі осаду проводити фільтрування.
Одержану осаджену білкову фракцію для продовження досліджень необхідно піддати очистці від солі. Для цього осад розчиняють. Знову розчинений осад містить значні кількості сульфату амонію, який необхідно видалити перед наступною стадією очищення. Для цього зазвичай використовують такі методи, як діаліз або хроматографічні методи очистки та розділення. Найбільш використовуваний метод на першому етапі це: гель-фільтрація на «знесолюючих» колонках (розд. 3.4 . гель-фільтрація)
У багатьох випадках після фракціонування сульфатом амонію використовують більш складні методи (наприклад, іонообмінну хроматографію (розд. 4.3) або афінну адсорбційну хроматографію (розд. 4.5)