Хід роботи:

Метміоглобін піддають гельфільтрації на колонці з G-25 для очистки від сульфату амонію. Обезсолений міоглобін фільтрують через G-25 з 0,005 М тріс-НCl буфером, рН 8,5-8,8. Проводять тест – аналіз на визначення рН білка зв’язаного з іоннообмінником. Іоннообмінник, що використовується, активується наступним чином: ДЕАЕ-целюльозу заливають невеликим об’ємом дистиляту, додаючи до смоли, що набухла, 0.1 н NaOH, перемішують на протязі 3-х хв., залишають для декантації маленьких частинок смоли. Потім зливають надосадову частину, яка неосіла на протязі 10 хв. До осаду смоли додають велику кількість води і відмивають NaOH, одночасно декантуючи смолу. За ступенем відмивання від лугу слідкують за допомогою індикаторного паперу. При досягненні нейтрального значення рН додають 0,1 н НCl і витримують смолу такий самий час, як і з NaOH (10 хв.). Відмивають НCl шляхом описаної вище процедури.

Після досягнення нейтрального значення рН до суспензії смоли додають тріс-НCl-буфер, вносять смолу в колонку для хроматографічного аналізу і стабілізують до вихідного стану смоли (рН 8.3, 0,005 М буфер). Попередньо стабілізований білок у вказанному буфері вноситься в колонку і хроматографується при швидкості виходу буфера з колонки, що дорівнює 40 мл в год. Заміну буферів, з зростаючою молярністю проводять по мірі виходу з колонки неадсорбованих компонентів. Вміст білка в пробах визначають спектрофотометрично, використовуючи коефіцієнт екстинції. Будують графік елюції.

Для одержання однорідного препарата міоглобіну, фракції, одержані в результаті хроматографії на ДЕАЕ-целюльозі піддають рехроматографії. Для цього проби однієї зливають в один стакан, розводять водою до іонної сили суміші 0.01 М, додаючи невелику кількість сухого кристалічного KH₂PO₄, доводять величину рН до 6,5. Рехроматографію проводять на КМ-целюльозі-32. При цьому значенні рН білок зв’язування всього рехроматографованого білка, проводять ступеневу елюцію, збільшуючи молярність фосфатного буферу.

Диск-електрофорез.

Дослідження гетерогенності взірців проводили методом диск-електофорезу в поліакриламідному гелі, описану Маурером. Цей метод являє собою об’єднаня методів розділення макромолекул по молекулярній масі і заряду та має високу розділяючу здатність.

З хімічною точки зору, поліакриламід який використовуються для електофорезу є сополімером двох мономерів: акриламіду і метиленбісакриламіду. Структура полімеру описується наступною формулою:

-СН₂-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН₂)-

-СН₂-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН₂)-

Гідрофільні властивості цього гелю викликані наявністю амідних груп, які повторюються через рівні інтервали.

Процес полімеризації акриламіду і метиленбісакриламіду починається в присутності тетраметилметилендіаміна (ТЕМЕД) та каталізатора персульфат амонію ((NH₄)₂SO₄).

Змінюючи концентрацію акриламіду і метиленбісакриламіду можна отримати гель з бажаючими розмірами пор.

При виборі концентрації акриламіду для отримання гелю враховують орієнтовану молекулярну масу фракціонованих речовин і форму їх молекул. Ми використовували гель 7.5%.

Обладнання: скляні трубочки, прилад для електрофорезу, джерело живлення.

Реактиви: Нами була вибрана наступна система для проведення диск-електрофореза:

1. Для приготування гелів:

Реактив А: 1 н НCl - 12 мл

ТРИС - 9.16 г

ТЕМЕД - 0.06 мл

Вода (б.дист.) - 25 мл

Реактив В: 1 н НCl - 12 мл

ТРИС - 1.495 г

ТЕМЕД - 0.115 мл

Вода (б/дист.) - 25 мл

Реактив С: метиленбісакриламід - 0.184 г

акриламід - 7 г

Вода (б. дист.) - 25 мл

Реактив D: метиленбісакриламід - 0.625 г

акриламід - 2.5 г

Вода (б. дист.) - 25 мл

Примітка: Акриламід та метиленбісакриламід розчиняти окремо (загальний об’єм зберігається).

Реактив Е: 0.004% рибофлавін (1 мг висушують на протязі доби під H₂SO₄ і розчиняють 25 мл бідистиляту).

Реактив F: 40% cахароза (40 г сахарози до 100 мл води б/д).

Персульфат амонію: 0.14% розчин (14 мг персульфату в 10 мл води б/д).

(Готують безпосередньо перед приготуванням гелю.)

2. Тріс-гліциновий буфер 0.05 М рН 8.3:

Тріс – 6 г + Гліцин – 28,8 г. + Вода бідист. – до 1 л.

Пред заповненням електрофоретичних камер буфер розвести в 10 разів.

3. Фіксуються: 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчиним оцтової кислоти.

4. Фарбуються: 0,1% розчином Кумассі G-250 або амідочорним B-10.