Дослідження гетерогенності міоглобіну.

Різними методами було встановлено, що міоглобіни виділені з м’язів різних тварин являються гетерогенними. для дослідження гетерогенності міоглобіну застосовують диск-електофорез в ПААГ та іоннообмінну хроматографію.

3. Диск-електрофорез.

(Приготування реактивів представлено окремо).

Хід роботи:

Метод має високу розділяючу здатність, оскільки, використовуючи його можна розділити білки як за молекулярною масою, так і за величиною заряду.

В якості каталізітора полімеризації акриламіду і метиленбісакриламіду використовують персульфат амонію, який може привести до окислення міоглобіну і до появи додаткових фракцій. В зв’язку з цим безпосередньо перед дослідом проводять “холостий” електрофорез для видалення персульфату амонію, а також інших низькомолекулярних речовин, що знаходяться в гелі.

Концентрація міоглобіна, що наноситься в трубочку, складає 100-150мкг. Для швидкого визначення концентрації білка можна використовувати спектрофотометричний метод, знаючи коефіцієнт екстинції.

Зразок, що вноситься, змішують з 40% розчином сахарози. Об’єм зразка з сахарозою не повинен перевищувати об’єму концентруючого геля.

Електофорез протікає 1,5-2 години, сила струму на одну трубочку складає 4 мА.

По закінченню електрофорезу гелі фіксуються 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчином оцтової кислоти на протязі 15-20 хвилин, потім відмиваються водою, фарбуються на протязі 10 хв. 0,1% розчином Кумассі-G-250 або 5 хвилин амідочорним 10-В. Надлишок фарби відмивають 7%-ним розчином оцтової кислоти.

Оскільки міоглобін має пероксидазну активність, можна провести ідентифікацію тільки гемвмісних фракцій, Для цього трубочки гелю не потрібно фіксувати, а відразу після електрофореза поміщують в розчин, що містить 0,2 г бензидину і 0,5 мл оцтової кислоти (льодової) на 100 мл води. Безпосередньо перед застосуванням цього розчину додають 0,2 мл 30% Н₂О₂. Зони, що відповідають хромопротеїду, фарбуються в синій колір.

Одержані результати деситометрують на денситометрі і проводять обробку електрофореграм.

3. Фракціонування на іоннообмінниках.

Для хроматографічного аналізу міоглобінів використовують ДЕАЕ-целюльозу або ДЕАЕ-сефадекс. Перед фракціонуванням кристалічний препарат міоглобіну переводять в метформу, додаючи до розчиненного в мінімальній кількості бідистилята міоглобіну ферріціанід калію.

Обладнання і матеріали: колонка з G-25 (діаметром ~2см висотою 50см), іоннообмінник, спектрофотометр, метміоглобін, ДЕАЕ-целюльоза.

Реактиви: 1. Тріс- НCl буфер, рН 8.3. – Готують вихідний 1м розчин трісу на бідистиляті (12,12 г трісу в 100 мл води) додаючи по краплях конц. НCl доводять рН до 8.3. Шляхом розведення готують буферні суміші з молярністю 0.005, 0.01, 0.05, 0.1 М розчини.

2. 0,1 н НCl.

3. 0.1 н NaOH.

5. Фосфатний буфер, рН 6.5:

Готують вихідні розчини 0.2 М KH₂PO₄ (М=139 - 6.804 г розчинити в 250 мл деіонізованої води), 0.2 М NaH₂PO₄ (М=141,96 - 7.098 г розчинити в 250 мл деіонізованої води);

26.2 мл 0.2 М NaH₂PO₄ титруємо 0,2 М розчином KH₂PO₄ до рН 6,5.

Для отримання 0.01 М буферу одержаний після титрування буфер розводять деіонізованою водою в 20 разів. Контролюють іонну силу буфера за допомогою кондуктометра.