3. Хроматографія білків на км-целюльозі.

Гемоглобін окремих видів тварин складається з близьких по структурі молекул і може бути розділений на фракції. Одним з методів вивчення фракціонного складу гемоглобіну є іоннообомінна хроматографія.

Обладнання: колонка з КМ-целюльозою фірми “Reanal”, спектрофотометр СФ-4А, вага.

Реактиви: 1. 0.5 М NaOH.

2. 0.5 М НCl.

Хід роботи:

Багатокомпонентність гемоглобіну вивчали методом іоннообомінної хроматографії на КМ-целюльозі фірми “Reanal” з номінальною ємкістю 0.7  0.1 екв./г за методикою Петерсона і Собера. Перед заповненням колонок целюльзу 15 хвилин суспендували 5-ти кратною кількістю 0.5 М NaOH, відмивали водою до нейтрального рН. Перемішуючи на протязі 15 хвилин целюльозу 5-ти кратною кількістю 0.5 М НCl, переводили її в Н⁺-форму. Після цього КМ-целюльозу вівмивали бідистильованою водою до нейтральної реакції, суспендували в 0.01 н натрій-фосфатному буфері рН 6.8 (стартовому) та заповнювали колонки розміром 2.850 см. Висота гелю дорівнює 40 см. На врівноважену стартовим буфером колонку наносили 400 мг розчину гемоглобіну завчасно діалізовану проти стартового буферу. Елюцію проводили 0.01 н натрій-фосфатним буфером в лінійному градієнті рН 6.8-7.6 на автоматичному апараті для хроматографії. Швидкість елюції 1 мл/хв., об’єм проб 5 мл. Екстинцію вимірювали на спектрофотометрі при 540 нм. За результатами спектрофотометричних вимірів будували криву елюції. Кількісну оцінку окремих фракцій гемоглобіну проводили методом зважування площі ділянок пиків, які окреслені гаусовської кривої.

Диск-електрофорез

Дослідження гетерогенності взірців проводили методом диск-електофорезу в поліакриламідному гелі, описану Маурером. Цей метод являє собою об’єднаня методів розділення макромолекул по молекулярній масі і заряду та має високу розділяючу здатність.

З хімічною точки зору, поліакриламід який використовуються для електофорезу є сополімером двох мономерів: акриламіду і метиленбісакриламіду. Структура полімеру описується наступною формулою:

-СН₂-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН₂)-

-СН₂-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН₂)-

Гідрофільні властивості цього гелю викликані наявністю амідних груп, які повторюються через рівні інтервали.

Процес полімеризації акриламіду і метиленбісакриламіду починається в присутності тетраметилметилендіаміна (ТЕМЕД) та каталізатора персульфат амонію ((NH₄)₂SO₄).

Змінюючи концентрацію акриламіду і метиленбісакриламіду можна отримати гель з бажаючими розмірами пор.

При виборі концентрації акриламіду для отримання гелю враховують орієнтовану молекулярну масу фракціонованих речовин і форму їх молекул. Ми використовували гель 7.5%.

Обладнання: скляні трубочки, прилад для електрофорезу, джерело живлення.

Реактиви: Нами була вибрана наступна система для проведення диск-електрофореза:

1. Для приготування гелів:

Реактив А: 1 н НCl - 12 мл

ТРИС - 9.16 г

ТЕМЕД - 0.06 мл

Вода (б.дист.) - 25 мл

Реактив В: 1 н НCl - 12 мл

ТРИС - 1.495 г

ТЕМЕД - 0.115 мл

Вода (б/дист.) - 25 мл

Реактив С: метиленбісакриламід - 0.184 г

акриламід - 7 г

Вода (б. дист.) - 25 мл

Реактив D: метиленбісакриламід - 0.625 г

акриламід - 2.5 г

Вода (б. дист.) - 25 мл

Примітка: Акриламід та метиленбісакриламід розчиняти окремо (загальний об’єм зберігається).

Реактив Е: 0.004% рибофлавін (1 мг висушують на протязі доби під H₂SO₄ і розчиняють 25 мл бідистиляту).

Реактив F: 40% cахароза (40 г сахарози до 100 мл води б/д).

Персульфат амонію: 0.14% розчин (14 мг персульфату в 10 мл води б/д).

(Готують безпосередньо перед приготуванням гелю.)

2. Тріс-гліциновий буфер 0.05 М рН 8.3:

Тріс – 6 г + Гліцин – 28,8 г. + Вода бідист. – до 1 л.

Пред заповненням електрофоретичних камер буфер розвести в 10 разів.

3. Фіксуються: 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчиним оцтової кислоти.

4. Фарбуються: 0,1% розчином Кумассі G-250 або амідочорним B-10.