3.5.7. Автоокислення оксигемоглобіну.

Автоокислення. Метгемоглобін як оксигемоглобін і дезоксигемоглобін є найбільш фізіологічно важливим похідним гемоглобіну. Поява у крові великої кількості метгемоглобіну (гемоглобіну) зустрічається за самих різноманітних патологічних станів. Однак, гемоглобін, який утворюється у незначних кількостях за нормальних умов , швидко відновлюється в гемоглобін за допомогою спеціальних ферментативних систем еритроцита. Реакція Hb ↔ MetHb, поряд з реакцією Hb ↔ HbO₂ відіграє важливу фізіологічну роль, оскільки присутні завжди невеликі кількості MetHb захищають окисно-відновні ферменти тканин від інактивації ціанистими сполуками, сульфідами тощо. Відомо, що максимальна швидкість окиснення гемоглобіну спостерігається за низьких значень парціального тиску кисню і зростання швидкості оксигенації знижує швидкість окиснення.

Хід роботи

У роботі використовується препарат гемоглобіну (HbO₂) .

Обладнання: Спектрофотометр СФ-46, ФЕК- , піпетки, пробірки, штатив, термостат, кювети.

Реактиви:

1. Гемоглобін.

2. Ферріціанід калію (K₃Fe(CN)_6.).

3. 0,01 М KCl, рН 7,0.

4. 0,1м Тріс- НCl буфер, рН 7,2.

5. 1мМ ЕДТО.

6. Дітіоніт натрію (Na₂S₂O₄).

Хід роботи:

Приготування інкубаційної суміші. Хід визначення.

1. У пробірку, що містить 5 мл тріс- НCl буфер, рН 7.2, 0.1М та 1мМ ЕДТО попередньо відфільтрованого на стерильних нітроцеллюльозних фільтрах, додають таку кількість HbO₂, щоб оптична густина розчину при 576 нм дорівнювала приблизно 1,0 (співвідношення при 576/541 нм для НbO₂ = 1,6 – 1,8 ).

2. Перенести в стерильні кювети від ФЕКу одержані розчини, закрити кювети кришками, не допускаючи утворення пухирців. Запаяти за допомогою розплавленого парафіну. Для запобігання контакту розчину у кюветі з повітрям можна обережно наслоїти на нього тонкий шар олії.

3. На саморегулюючому спектрофотометрі провести регістрацію спектра поглинання досліджуваного оксигемоглобіну у видимій ділянці спектру (400-600 нм). У випадку відсутності саморегулюючого спектрофотометра визначають оптичну густину розчину на звичайному спектрофотометрі при 576 нм (для НbO₂), або при 630нм чи 505 нм (характеристичні максимуми для метгемоглобіну). Поміщають кювету в термостат на 37С. Регістрацію змін спектральних характеристик оксигемоглобіну здійснюють через кожні 20 хв.

Форма звіту: Використовуючи одержані дані, побудувати графік залежності інтенсивності накопичення метгемоглобіну від часу інкубації розчину НbO₂ в умовах низьких значень рО₂ в системі півлогарифмічних координат.

Враховуючи, що автоокислення НbO₂ є реакцією першого порядку розрахувати константу швидкості автоокислення досліджуваного міоглобіну.

Визначення спорідненості гемоглобну до кисню за методикою Іванова

Спектри поглинання оксигенованого і дезоксигенованого (нелігандованого) гемоглобіну в інтервалі 400-800 нм істотно відрізняються. На врахуванні цієї різниці заснованого метод спектрофотометричного аналізу сумішей окси- і дезоксигемоглобіну. Для аналізу використовували спеціальний прилад (рис. 1), виготовлений одним з авторів даної статті. Він складається з тонометра, з`єднаного з манометром, і додаткових пристосувань. Тонометр виготовлений з кварцового скла (загальний об`єм 70 мл) і має в основі стандартну спектрофотометричну кювету (довжина пробігу променя 10 мм).

Рис. 1. Прилад для визначення КДК гемоглобіну: 1 - манометр; 2 - тонометрична частина; 3 - спектрофотометрична кювета.

Кювету заповнюють 4 мл розчину гемоглобіну і занурюють в лід, щоб запобігти виникненню піни під час відкачування повітря. Закривають тонометр скляним корком з вакуумною змазкою. Наступне проникнення газів в тонометр регулюється системою краників. Відкачують повітря високовакуумним насосом, обладнаним вловлювачем. При цьому необхідно уникнути бурхливого "кипіння" розчину, яке приводить до денатурації білку. Після остаточного виділення газових бульбашок вакуумування продовжують, обережно струшуючи рукою горизонтально розміщений тонометр. Для кращої деоксигенації розчин у кюветі повільно нагрівають до кімнатної температури.

Ступінь перетворення гемоглобіну в деоксиформу контролюють спектрофотометрично за критерієм повної деоксигенації (Д - оптична густина розчину при даній довжині хвилі). Для повністю деоксигенованого гемоглобіну [15], в наших умовах придатним для досліджень вважали розчин з коефіцієнтом .

Після тонометрування при постійній температурі в ультратермостаті визначали оптичну густину розчину при 558 нм на спектрофотометрі СФ-4А, обладнаному подовжуючою насадкою. Далі в тонометр запускали певні порції повітря, збільшуючи парціальний тиск кисню і після кожної кювету тонометрували протягом 10 хв. Останні виміри проводили при І00%-ій оксигенації гемоглобіну після витримування розчину при атмосферному тиску. Так проведено 6-7 вимірів, на основі яких побудовано киснево-дисоціаційні криві (КДК) гемоглобіну.

Кінцевий тиск кисню в тонометрі визначали в мм рт. ст за формулою:

,

де - парціальний тиск кисню, - атмосферний тиск, - тиск пари води, - вміст кисню в повітрі, %. Парціальний тиск кисню визначали за його вмістом у повітрі і тиском повітря над розчином.

Насичення гемоглобіну киснем обчислювали за формулою

,

де - оптична густина деоксигемоглобіну, - оптична густина оксигемоглобіну, - оптична густина розчину гемоглобіну при даному парціальному тиску кисню.

Молярна концентрація різних форм гемоглобіну визначалася з рівнянь

;

;

,

де Нb, , і Нb+ - відповідно концентрації деокси-, окси-, і мет- форм гемоглобіну.

Концентрація метгемоглобіну у більшості дослідів практично дорівнює нулю. Похибка методу залежить від класу точності манометра. При побудові КДК на осі абсцис відкладають парціальний тиск кисню або його десяткові логарифми, а на осі ординат – насичення гемоглобіну киснем (у процентах).

Для аналізу використовували розчин гемолізату в 0,02 М тріс-НСІ буфері /рН 7,2/,що містить 1 мм ЕДТА. В межах рН 7-9 сольовий ефект цього буферу незначний - порівняно з NaCl і фосфатними буферами [17]. Відцентрифуговані і тричі промиті 0,9%-вим розчином NaCl еритроцити гемолізували дистильованою водою. Гемолізат центрифугували при 10 000 об/хв і фільтрували для відокремлення строми і одержання оптично прозорого розчину. Процедуру проводили при температурі 2-4º С. Гемолізат містить гемоглобін в умовах, що наближаються до внутрішньо еритроцитарних / Р₅₀ - тиск півнасичення гемоглобіну киснем цільної крові - наближається до P₅₀ гемоглобіну в розчині з відповідним вмістом 2,3-ДФГ [14].

При виборі концентрації гемоглобіну ми виходили з міркувань забезпечення зручності використання шкали спектрофотометра і забезпечення мінімальної концентрації гемоглобіну 10^-5 – 10^-6 М, при якій часткове окислення і розпад гемоглобіну на димери не впливає на характер його деоксигенації і реоксигенації [l6]. В наших дослідах концентрація гемоглобіну становила 5-7‪ 10^-5 М, КДК визначались при температурі 20°С - оптимальній для підтримання стабільної концентрації гемоглобіну та інших умов при вимірах.

Для запобігання змін концентрації 2,3 - ДФГ і молочної кислоти, що впливають на Р₅₀ гемоглобіну [7, 12] КДК визначали відразу ж після одержання гемолізату, двічі друга порція гемолізату зберігалась в холодильнику протягом 1,5 год.