10 % Розчином таніну, промивають водою і розглядають в надавленій краплі 0,02 %

водного розчину кристалічного фіолетового. Забарвлюються оболонки в фіолето-

вий колір вже через 5-10 с.

Метод __________яяяяяяяяКнайзі. Зафіксований у полум’ї пальника мазок протравлюють у спеці-

альному розчині (насичений водний розчин калійних галунів – 70 мл, 20 % розчин

таніну – 30 мл), промивають водою, наносять краплю фенолового фуксину, на-

кривають покрівним скельцем і розглядають під мікроскопом. Клітинна стінка

фарбується в червоний колір.

Забарвлення капсул. Капсули бактерій містять

складні гетерополісахариди і поліпептиди, мають

гелеподібну консистенцію. При звичайних методах

фарбування вони погано сприймають барвники.

Лише у препаратах-відбитках з уражених тканин і

органів, мазках із гною, харкотиння вони виявля-

ються при будь-якому методі фарбування у вигляді

незабарвлених зон (ореолів) між забарвленими тіла-

ми бактерій і субстратом (рис. 13). Для фарбування

самих капсул запропоновані різні методи.

Спосіб Ребігера. Нефіксований мазок забарв-

люють насиченим розчином генціанового фіолето-

вого у 40% формаліні протягом 15-20 с, швидко промивають водою і висушують.

Капсули фарбуються у червоний, а бактерії – в темно-фіолетовий колір.

Метод Гінса. З досліджуваного матеріалу роблять негативний препарат за

способом Буррі. Мазок фіксують сумішшю Никифорова, або метанолом, промива-

ють водою і забарвлюють 3-5 хв за Гінсом феноловим фуксином Циля, розведеним

1:3. Промивають водою, висушують, мікроскопують під імерсійним об’єктивом. На

темному димчасто-сірому фоні контрастно виділяються незабарвлені капсули, все-

редині яких знаходяться яскраво-червоні тіла бактерій (див. вкл., рис. 5).

Метод Гісса. Тонкий мазок фіксують у спирт-формолі або суміші Никифорова

(але не жаром), фарбують розчином основного фуксину (1 ч насиченого спиртового

розчину барвника + 19 ч дистильованої води) з підігріванням до появи парів, потім

залишають на 30 с для охолодження. Препарат промивають великою кількістю

розчину мідного купоросу, висушують, не промиваючи водою, і мікроскопують.

Капсули забарвлюються в голубий колір, тіла мікробів – у темно-червоний.

Метод Романовського-Гімзи. На мазок, фіксований метанолом або сумішшю

Никифорова, наносять розведений барвник Гімзи (2 краплі на 1 мл дистильованої

води), фарбують 20-30 хв, швидко змивають водою, висушують і мікроскопують.

Бактерії забарвлюються в синій колір, капсули – у блідо-рожевий. Метод постійно

дає хороші результати. Інші способи забарвлення капсул менш демонстративні.

Рис. 13. Капсули бактерій.

40 Частина і. Загальна мікробіологія

Забарвлення спор. Деякі бактерії при несприятливих умовах здатні утворю-

вати ендоспори. При дослідженні незабарвлених мазків із старих агарових куль-

тур спори виявляються у вигляді круглих, або овальних утворень, які сильно за-

ломлюють світло, і виглядають пустотами. Вони погано забарвлюються аніліно-

вими барвниками при звичайних методах фарбування.

Розміри спор можуть не перебільшувати діаметр мікробної клітини (Bacillus)

або бути більшими за нього (Clostridium). Спори в клітині можуть розміщуватись

центрально (збудник сибірки), субтермінально (палички ботулізму, газової ганг-

рени) або термінально (палички правця).

Для виявлення спор розроблені спеціальні методи їх забарвлення. Всі вони

основані на дії протрав, які розрихлюють міцні оболонки спор і полегшують про-

никнення барвників.

Метод Ожешки. На приготовлений густий незафіксований мазок споронос-

ної культури бактерій наливають 0,5 % розчин соляної кислоти й підігрівають 3-4

рази до появи парів (протрава). Препарат промивають водою, висушують фільтру-

вальним папером і фіксують у полум’ї пальника. Потім мазок забарвлюють за

методом Циля-Нільсена, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла

бактерій фарбуються в голубий колір, спори – в червоний (див. вкл., рис. 6).

Метод Пешкова – простий і надійний спосіб забарвлення спор, який не ви-

магає хімічних протрав і диференціювання в кислоті чи спирті. Його проводять за

таким алгоритмом:

1. Виготовляють мазок, висушують і фіксують у полум’ї газового ріжка, або

в спиртовому формаліні.

2. На препарат наливають лужний метиленовий синій і доводять його до ки-

піння, періодично вносячи в полум’я на 15-30 с.

3. Барвник змивають водою і додатково фарбують 0,5 % водним розчином

нейтрального червоного впродовж 30-40 с. Промивають дистильованою водою,

висушують, розглядають за допомогою масляної імерсії. Спори виглядають сині-

ми, або голубими, цитоплазма – рожевою.

Метод Мюллера. На зафіксований в полум’ї мазок наливають 5 % водний

розчин хромової кислоти на 2-3 хв, промивають водою, висушують і забарвлюють

за методом Циля-Нільсена, мікроскопують. Спори набувають червоного кольору,

а цитоплазма бактерій – синього.

Метод Шеффера-Фултона. Густий мазок фіксують у полум’ї, наливають

5 % водний розчин малахітового зеленого, 3-4 рази нагрівають до появи парів,

промивають струменем проточної води 30-40 с і додатково забарвлюють 0,5 %

водним розчином сафраніну, промивають водою і мікроскопують. Тіла бактерій

забарвлюються в червоний, а спори – в зелений колір.

Забарвлення джгутиків. У деяких видів плаваючих бактерій є спеціальні

органи руху – джгутики, розміри яких досягають 0,02-0,04 мкм у ширину і 6-80 мкм

у довжину. Вони містять особливий скоротливий білок флагелін. За кількістю і

розташуванням джгутиків рухливі бактерії поділяють на 4 групи:

1. Монотрихи – один полярно розташований джгутик (холерний вібріон);

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів 41

2. Лофотрихи – пучок джгутиків на одному кінці (псевдомонади);

3. Амфітрихи – поодинокі або пучки джгутиків на обох кінцях бактерій (спірили);

4. Перитрихи – багато джгутиків, розташованих навколо клітини (збудник

черевного тифу, кишкова паличка).

Число, спосіб розміщення і розміри джгутиків є постійними ознаками для

певного виду бактерій, що враховують при проведенні їх систематики.

Виявити джгутики можна за допомогою прямих та непрямих методів. При

прямих методах джгутики забарвлюють барвниками або солями металів. Обов’яз-

ково вживають протрави, які сприяють осіданню на джгутиках препаратів срібла

або заліза, що призводить до штучного збільшення їх діаметра. Вони стають ви-

димими під світловим мікроскопом. До прямих методів виявлення джгутиків відно-

сяться і дослідження їх під електронним мікроскопом на ультратонких зрізах.

При непрямих методах спостерігають за рухом бактерій у висячій або надав-

леній краплі за допомогою світлової, темнопольної, фазово-контрастної та анопт-

ральної мікроскопії.

Забарвлення джгутиків – одна з найтонших, складних і вимогливих бактеріоско-

пічних методик. Запропоновано багато складних методів їх фарбування: Леффлера,

Грея, Морозова, Уварова, Бенін’єтті та ін. Найнадійнішим із них є метод Леффлера.

Метод Леффлера. Важливою умовою для успішного забарвлення є виготов-

лення мазків із молодої (12-18 год) агарової культури на ідеально чистих і знежи-

рених скельцях. Бактеріологічною петлею беруть невелику кількість культури і

вносять її в 5-6 мл водопровідної води, не емульгуючи, а залишаючи петлю до тих

пір, поки бактерії самі розійдуться в рідині. Пастерівською піпеткою з тонко відтяг-

нутим капіляром наносять на скельце 5-6 окремих крапель суспензії бактерій у

воді, висушують на повітрі. Фіксують дуже обережно, один раз швидко провівши

препарат через полум’я.

Для забарвлення необхідно приготувати такі розчини:

1. Протрава: 1 мл насиченого спиртового розчину основного фуксину, 10 мл

20 % водного розчину таніну, 5,5 мл насиченого на холоді водного розчину сірча-

нокислого закисного аміачного заліза. Розчин готують за 1-2 доби до вживання,

перед використанням обов’язково фільтрують.

2. Концентрований феноловий фуксин Циля, наполовину розведений водою і

профільтрований.

На фіксований препарат наносять надлишок протрави й залишають її протя-

гом 10-15 хв, промивають дистильованою водою до повного видалення протрави.

Фарбують профільтрованим фуксином Циля протягом 3-5 хв, промивають водою,

висушують і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в темний червоно-ко-

ричневий колір, джгутики виглядають світлішими, такого ж відтінку.

Метод Бенін’єтті. Суспензію бактерій і мазок роблять так само, як і за

методом Леффлера. Протраву і забарвлення проводять одним фарбуючим розчи-

ном, який завжди готують ex tempore: розчин 1 – сірчанокислого цинку 1 г, таніну