- •Обмен белков и аминокислот как ядро клеточного метаболизма. Значение белкового обмена. Аминокислоты. Классификация, свойства аминокислот. Методы хроматографии. Основные вопросы
- •Теоретические представления в хроматографии
- •Классификация методов хроматографии
- •Теории хроматографического разделения
- •Ход по определению аминокислот с помощью радиальной хроматографии
Классификация методов хроматографии
Различные методы хроматографии можно классифицировать по агрегатному состоянию фаз, способу их относительного перемещения, аппаратурному оформлению процесса и т.д.
По агрегатному состоянию фаз хроматографические методы обычно классифицируют следующим образом:
Неподвижная фаза |
Подвижная фаза |
|
Газообразная |
Жидкая |
|
Твердая |
Газоадсорбционная хроматография |
Жидкостно-адсорбционная колоночная Ионнообменная Осадочная хроматография |
Жидкая
|
Распределительная газо-жидкостная хроматография |
Распределительная жидкость-жидкостная хроматография |
По механизму взаимодействия сорбента и сорбата можно выделить несколько видов хроматографии:
– адсорбционная хроматография основана на различии в адсорбируемости веществ твердым сорбентом;
– распределительная хроматография – на различии в растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе (газовая хроматография) или на различии в растворимости веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах;
– ионообменная хроматография – на разной способности веществ к ионному обмену;
– эксклюзионная хроматография – на различии в размерах и формах молекул разделяемых веществ;
– аффинная хроматография – на специфических взаимодействиях, характерных для некоторых биологических и биохимических процессов.
По технике выполнения различают:
– колоночную хроматографию (разделение проводится в специальных колонках);
– плоскостную хроматографию, когда раз деление проводится на специальной бумаге (бумажная хроматография) или в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография).
По цели хроматографирования выделяют:
– аналитическую хроматографию (качественный и количественный анализ);
– препаративную хроматографию (для получения веществ в чистом виде, для концентрирования и выделения микропримесей);
– промышленную (производственную) хроматографию для автоматического управления процессом.
По способу относительного перемещения фаз различают:
– фронтальную;
– проявительную, или элюентную;
– вытеснительную хроматографию.
В хроматографии подвижную фазу, вводимую в слой неподвижной фазы, называют элюентом, а подвижную фазу, вышедшую из колонки и содержащую разделенные компоненты, – элюатом.
Этот метод широко используется как для качественного обнаружения отдельных аминокислот, так и разделения смеси аминокислот. Его достоинством является то, что он позволяет исследовать ничтожное количество вещества.
Разделение аминокислот основано на их различной растворимости в нескольких несмешивающихся жидкостях (фазах). Одной из жидкостей служит вода, которая прочно ассоциируется с молекулами целлюлозы и образует неподвижную фазу. Менее полярные, водонасыщенные органические растворители (изобутиловый, изопропиловый, бутиловый спирт, фенол и др.), составляют подвижную фазу. Подвижный органический растворитель поднимается по полоске бумаги, растворяет нанесенные на бумагу аминокислоты и увлекает их за собой. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от степени их растворимости в подвижных и неподвижных фазах. Чем больше растворимость аминокислот в водной фазе и чем меньше ее растворимость в неводной фазе, тем медленнее движется аминокислота по сравнению с фронтом органического растворителя. Иными словами, аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (гли, лей, изо, фен, трп, вал, мет, тир), перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими боковыми цепями (про, ала, гли) или с полярными боковыми цепями (тре, глу, сер, арг, асп, гис, лиз, цис).
Положение отдельных аминокислот на хроматографической бумаге обнаруживают при помощи цветной реакции с нингидрином.
Идентификация отдельных аминокислот на хроматограмме проводят путем нанесения на ту же хроматограмму "свидетелей" — растворов отдельных аминокислот. Можно также идентифицировать аминокислоты по величине Кс равной отношению пути, пройденного аминокислотой (от места нанесения) (а) к расстоянию, пройденному растворителем (от места смеси аминокислот до фронта растворителя) (в).
Коэффициент Кс — величина, характерная для каждой аминокислоты и постоянная при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги).
Возможны разные варианты хроматографии на бумаге: нисходящая, восходящая, радиальная.