Тимин_О_А_Лекции_по_общей_биохимии

Ферменты

60

П Р ИКНОЦЛИПЧЫЕС Т В Е Н

Н ОГПОР Е Д Е Л Е Н И Я

А К ТФИЕВРНМОЕСНТТИО В

1Акти. ферментавыражаетсяность

скоростинакопленияпродуктаскоростилиубыли

субстрата впересчетенаколичествоматериала,содержащегофермент.

Активность

фермента =

Количество продукта

или субстрата

Количествовремени × Масса или объем пробы

В практике обычно используют:

o

единицыколичествавещества

– мольи(

производныемм, кмоль),граммкг(,мг)

,

o

единицывремени

– минута,час,секунд

а,

o

единицымассилиобъема

– граммкг(,мг),литрмл().

Активноиспользуютсядругиепроизводные

– катал (моль/с)

, международная еди-

ница активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Такимобразом,актив

ностьферменможевыражаться,н пример,

вммоль/с

×л,

г/час ×л,МЕ/л,кат/мли.д.

2. Создстандартныхусловийие

,чтоможнобысравниватьл

результаты,

полученные

вразныхлабораториях

– оптимальнаярН,фиксированн

ая температура,например, С25°

или3 7°С,соблюдвремениинксубсфеациистр. ментомата

3. Избытоксубстрата

,чтобыработаливсеимеющие

сяврастворемолф .кулырмента

С В ОФЙЕСР МТВЕАН Т О В

1. Зависимость активностифермента

отте

м-

пературы – описываетсяколоколообразной

кривойсмаксимумом

скорости призначен

и-

яхоптимальной

температуры

дляданного

фермента.

Закоповышениискоростреакц2 ии

-4

разаприповышениитемпературына10°Сспр

а-

веидлфермивяе,накцийтолативных

ь-

ковпред елахдо55

-60°С,т.е.взначенияхд

о де-

натурациибелков.

Нарядусэт,какисключм

е-

н,имеютсяферменнекотомикырооргых

а-

низмов,существующихводегорячихисточн

и-

ковигейзеров.

Припонижениитемпературыактивнфермеонижаетсясть,нонеисчезаетов

тс о-

всем.Иллюстрациможетслужитьзимспячканеяякоторыхйживотныхсуслики( ,ежи),

температурателакоторых

понижаетсядо3

-5°С . Этосвойствоферментовтакжеиспользу

ется

вхирупргическойприактикепровоперацийнадениигруднпол,кбольноггдастий

о

подвергаютохлаждениюдо22°С.

Ферменты

62

V =

Vmax×[S]

Km + [ S]

УравнениеМихаэлиса

-Ментен

Выделяют три решенияуравнения

:

1Концентрация. субстрата

равна величинеконстанстыМихаэлиса

([S] = Km).Вэтом

случае,решур Михаэлисавнениея

-Ментен,получа,чтоскоростьеакциим

V будетравна

половине максимальной Vmax.(V = ½ Vmax).

В математическом смысле Km соответствуетконцентрациисубстратапри орой

скоростьреакцииравнаполовине

максимальной.

2Концентрация. субстрата

[S] значительно больше Km ([S] >> Km)В.этомслучае,в

е-

личиной Km можнопренебри ешиполучечьнии

аем,чтоскоростьреакциимакс мальна

(плнаграфикето)

.

значительно меньше Km ([S] << Km)В.этомслучае,

3.Концентрациясубстрата

знаме-

нательуравнениямалоизменяется

приизменении

[S],авеличина

скоростиреакц и

V прямо

С П Е Ц И Ф И Ч Н О С Т Ь Ф Е Р М Е Н Т О В

Специфичоснкомплементаованаостьструктусубстиактивногорыатаности

цен-

трафермента.

1. Стереоспецифичность – катоаоднлькостереоизомеровго

,например :

o

специфичностьк

L- или D-аминокислотам – например,

почтивсеферментычелов

е-

кавзаимодействуют

L-аминокислотами,

o

специфичностьк

цис- и транс-изомерам. Например,аспартазареагируеттолько

транс-изомером – фумаркислотой,ннемалеатомвойцис(

-изомер),

biokhimija.ru

ТиминО.А.

Лекции по общей биохимии (2018г)

63

2. Абсолютная специфичность – ферментпрои

зводиткатоаоднлькоизвещества.го

Например, уреаза расщепляеттолькомочевину

, глюкокиназа фосфорилируеттолько

D-

глюкозу.

3. Групповая специфичность – катализсубстратобщимиструктурвсобенностями, ыми

т.е.приналичииопределенной

связи илих мической

группы:

субтилизин специфи-

o

наличиепептиднойсвязи

,например,

• бактериальныйфермент

чен кпептиднойсвязинезависимоотстроенияобрееаминокислотзующих,

• пепсин

катализируетразрывпептиднойсвязи,образованной

аминогруппамиароматических

аминокислотсм(

"Внешнийобменбе

лков"), • тромбин всвоихсубстратах

расщепляет

пептиднуюсвязь

толькомеждуаргин

иномиглицином.

o

наличиеОН

-груп,напримеры

, алкогольдегидрогеназа окисляетальдегидов

д-

ноатомнметаспиртэтанол( , ы

пропанол, ).

4. Относительнаягрупповая

специфичность – превращениесубстранекотоврыми

б-

щимипризнаками.

Например, цитохромР

450 окистогидрофобныелькояетвещества,к

о-

торыхнасчитываетсяоколо7000.

МЕ Х АСПЕЦИФИЧНОСИ З М Ы

ТИ

Вобщемвидевсводитсяккомплементарномувзаимодейферменсубствию

а-

та.Приэтомфункциональныегруппысубстратавзаимодействую

тссоответствующими

функциональгруппамиферме. нымита

Наличиесубстратной

специфичобъясдвеняютости

гипотезы:

1. ГипотезаФишера

(модж"ематрицыстль",ключой"

-замок")

– активныйцентр

ферменстрогосооконфигаветствсубстратанеизмеетрации

няетсяприегоприсоед

и-

нении.Этамодель

хорошообъяабсняолютнуюспецифичн,нонегрупп. остьвую

2. ГипКошлтезанда

(модельиндуцированного" соответствия",рука"

-перчатка")

–

подразумгибктиостьцентра.вПриногоаетсубстратаоединениек

якорномуучастку

ферментавызывизмеконетениефигурациикаталитическцентратакимобразом,чтобыго

егоформасоответствовалаформесубстрата.

Р Е ГАУКЛТЯИЦВИНЯО С Т И

Ф Е Р М Е Н Т О В I N V I V O

Активносфермклнепетнтвременикеьвостоянна.Оначутко

реагнасирует

у-

ацию,вкоторойоказывклетка,наф ,воздействующкторысянаклеткукакснаруж, ие

такиизнутри.Главнаяцельэтойреакции

– отреагироватьнаизменениеокружающейсреды,

Ферменты

64

приспособиклеткуновымусловиям,датьдолжныйответнагормо

нальныеииныест

и-

мулы,авнекоторыхситуациях

– получитьшансвыжить

.

1. Доступноссубстратаь

иликофермента

Здесьработает

закондействиямасс

– фунда-

ментальныйзаконхимич:нетикиприпостской

о-

янной температуре скорость химическойреакции

пропорциональна произведению концентрации реа-

гирующих веществ. Илиупрощенно

– скорость,

о-

торойвеществареагидруг,зависитютгом

ихконцентрации.Такимобразом,

изменение количе-

ства хотябыодного

изсубстратов

прекращает или

начинает реакцию.

Напр,дляцтрикарбоновыхкламеркислот

а-

кимсубстратомявляется

оксалоацетат (щавелевоук-

суснаякислота

).

2. Компартментализация

Компартментализация –

это

сосредоточение

ферментовиихсубстратоводномкомпартменте

(однойорганелле)

–

в эндоплазматическомретику,митохондриях, умеизосома.

Напри-

мер, β-окислежиркислотпротекаетныхиевмитохондриях,синтезбелка

– врибосомах.

3. Генетическаярегуляци

– изменениеколичествафермента

Изменениеколичествафермента

можетпроисходить

врез ультатеувеличенияилисн

и-

жения его синтеза. Сэтозренияйчкиферментыможноподртриагруппызделить:

o

конституитивные – такиеферменты,котор е

образуютсяв

клеткепостоянно.

o

индуцируемые (адаптивные)

– синтэтихфермевозрастаетпринтоваличиисоо

т-

ветствующихимуловиндукторов( ).

o

репрессируемые – образованиетакихфермклпринеобходимоститкевпода

в-

ляется.

Изменескоростисиферментатезаиеиндукция( илирепрессия)обычнозав

иситот

количестваопредегорилименныхоноветабпр.оцессалитов

Примеры индуцируемых ферментов:

o

исчезновениепищеварительныхферменпридлиголоданииельномовиндукцияих

синтезаввосстановительперезультатеиодвозобсекрециингоыйвлениярмонов

ЖКТ,

o

гормоныглюкокортикоидыстимулируютсинтезферменсинтезаглюкозы(ов

о-

неогенеза),чтообестабпечконцильностьваглюкевнтрациикрпридлвизы

и-

тельнголиустойчданииимЦНСкстрес, востьу

o

токсубстратыическнапр( ,этанолибарбитемер

ураты)стимулируютвпечениси

н-

тезсвоего" "изоферментацитохромаР450,которыйок обезсляетэтивреживает

е-

щества.

Примеры репрессируемых ферментов:

o

подавлениесинтезатриптофанабактериямипридея ельнриптоперонастифа ового

(смРегуляция" транскр

ипции"),

o

впеченирепрессияферментасинтезахолестеролаГМГ

-SKoA-редуктазыподвлиянием

холестеринажелчныхкислот.

4. Ограниченный (частичный)

протеолиз проферментов

Синтез некоторых ферментовосуществляетсявиде

болеекрупного

предшественника

(трипсиноген, пепсиноген,прокарбоксипептидазы ,факторысвертыкрования

)и при

поступлениивнужноеместо

этотфермент

активируетсячерезотщеплениенегоодного

илинесколькихпептидныхфрагментов.

biokhimija.ru

ТиминО.А.

Лекции по общей биохимии (2018г)

65

Секррядафециярментовзапределы

клеткив

неактивномсостояниипозволяет

предохранитьклеткиотповреждения(

и-

щеварительныеферменты)илисохранить

белокдонаступленияопределенногом

о-

мента(

протромбин,

фибриноген,

белки

комплемента).

5.Аллостерическаярегуляция

.

Аллостерическиеферментыпост

рое-

ныиз

двухиболеесубъединиц

:

одни

субъединицы

содержат

каталитический

центр,друг

иеявляю

тсярегуляторн

ыми.

Присоединениеэффектора

аллостериче-

ской (регуляторной) субъединице изменяет

конформациюбелкаактивность

катали-

тической субъединицы.

Аллостерическиеферментыобычно

стоятвначалеметабпутей,иотлических

ихактизависиттеченностимногихп е

о-

следующихреакций.Поэтомуоничасто

называются ключевыми ферментами.

Вкачестве

отрицательногорегулят

о-

ра может выступать конечныйметаболит

биохимичепроцесскогоа

,

продукт данной

реакции,т.работа

ет механизм обратной

отрицательной связи.Еслирегуляторами

являютсяначальныйметаболитилису

б-

стратреакции,тоговорят

прямой регу-

ляции,о наможетбытькакположительной,

такиотрицательной.

Такжерегулятором

могутбытьметаббиохимическихл ты

путей,каким

-тообразомсвязд нных

н-

нойреакцией.

Наприэнергетического,фермент

распадаглюкозы,

фосфофруктокиназа,

регулируетсяпромежуточнымиконе

ч-

нымипродуктами

этогораспада

. Приэтом

АТФ,

лимоннаякислота

, фруктозо-1,6-

дифосфат являютсяингибитора

ми,афру

к-

тозо-6-фосфатиАМФ

– активаторами фермента.

6.Белок -белковоевзаимодействие

Терминбелок

-белковоевзаимодействобозначаетситуац,когдакачриеюствегул

я-

торавыступнеметаболитют

ыбиохимичепроцес,а совких

специфичные белки.

Влияние

каких-либофакторовнаэтибелкиизменяетихактони, ,всвочересть,ювоздеь

й-

ствуютнанужныйфермент.

аденилатциклаза являетсячувствительнымкво

К примеру,мембранныйфермент

з-

действиюмембранного

G-белка,которыйс ктивмпрдействиинаруетсяклетнекоту

о-

рыхгормонов(

например,

адреналинаи глюкагона).

Ферменты

66

Другимпримеромбелок

-белкового взаимодействия можбытьрегуляци

я активности

протеинкиназы А. Протеинкиназа Аявляетсятетрамернымферментом,состоящимизк2

а-

талитическихС)( регуляторных2 (

R)субъед.Актиницватором

для протеинкиназы Ая в-

ляется цАМФ.ПрисоединениецАМФкрегуляторнферментсубъединицвызывамет

изменениеих

конформации

отхождение откаталитическсубъедин.Каталитическиецх

субъединицыприэтомактивируются.

7. Ковалентнаяхимическая( )модификация

Ковалентнаямодификация

заключвобрприсаетилимомяединениитщеплении

опредегруппы,благоденнойчемуизменяактивноряфе.тсярментаЧащестакойеготь

группойявляется

фосфорнаякислота

,режеметильныеацетильнгрупп.Фосфорилые

и-

рованиеферментапроипостаткходит

амсерина,треонина,тирозина.

Присфоединение с-

форнойкислоты

кбелку осущферментыствляют

протеинкиназы, отщепление – протеин-

фосфатазы.

biokhimija.ru

ТиминО.А.

Лекции по общей биохимии (2018г)

67

Ферменмогутбытьаккакивныфосфорилированном,так

дефосфорилирован-

номсостоян.Напр,фериимернты

гликогенфосфорилаза и гликогенсинтаза вмышцах

принагрузке

фосфорилируются,приэтомфосфорилазагликогенстановитсяактивной

и

начинаетрасщеплениегликогена,

гликогенсинеактивнза

а.При

отдыхеи

синтезаглик

о-

гена оба фермента дефосфорилируются,синтаза приэтом

становитсяактивной,фосфорил

а-

за – неактивной.

Вмедицинеактивноразрабатываютсяиспользуютсясоедин,измактеняющие

в-

ностьферментовцельюрегуляциискоростиметаболическихреакцийуменьшениясинт

е-

заопределенвеществорга. ныхизме

Подавлактивфеобычнормиеостиназынтовнгибирают,одэтнеакованием

всегдакорректно.

Ингибитор – этовещество,вызывающее

специфичное снижениеакти

в-

ностиферме.Такимобразом,нтаеорганичкислотытяжеские

ыемет аллыингибиторами

неявляются,но

являются инактиваторами,т.к.снижаютактивность

многих ферментов,..

действуют неспецифично.

обратимым и

1По.прочностисвязыванферментаингингибированиеябиторомбывает

необратимым.

конку-

2По.отношенингибкактивноцентюторафеингибированиермууентаделятна

рентное и неконкурентное.

Н Е О БИРНАГТИИБМИОРЕО В

А Н И Е

Принеобратимомингибированпроисходит

связывание или разрушение функцио-

нальныхгруппфермента,необходимыхдляпроявле

нияегоактивности.

Например,

вещество диизопропилфторфосфат прочноинеобратимосвязывается

гидроксигруппой серина вактивномцентре

ацетилхолинэстеразы,гидролизующейацети

л-

холинвнервси.нИапсахых

нгибирование этогофермента

предотвращает распад ацетилхо-

линавсинаптищели,врезультадальнейшчегоотсутствускойпередачасигнпот лая

нерву.