- •Ветеринарная вирусология, ее достижения и задачи.
- •Вирионы - наиболее известная форма существования вирусов.
- •Вирусы как инфекционные агенты. Принципиальные отличия вирусов от других инфекционных агентов.
- •Генетические признаки вирусов и их использование в характеристике штаммов. Мутации у вирусов и их механизмы.
- •Действие на вирионы вирусов различных температур, уфл, кислот, щелочей, спиртов, дезинфектантов, окислителей и восстановителей, жирорастворителей, антибиотиков.
- •Диагноз на основе анализа клинических симптомов, патологоанатомических изменений и эпизоотологических данных.
- •18. Инактивированные вакцины.
- •19. Живые вакцины.
- •Значение вирусов для решения общебиологических проблем.
- •Индикация вирусов в патологическом материале по обнаружению вирионов и вирусных телец-включений.
- •Индикация, выделение и идентификация вирусов.
- •Обнаружение ( индикация) вируса в материале;
- •Иммуноферментный анализ. Достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Использование в вирусологии лабораторных животных. Устройство вивариев, правила техники безопасности при работе с лабораторными животными.
- •Масса животных в разном возрасте
- •Температура тела, пульс и число дыханий у здоровых животных
- •Состав крови некоторых лабораторных животных (по в.Н.Никитину)
- •Использование в вирусологии культур клеток. Типы культур клеток. Получение клеточных культур.
- •Клеточный геном и реализация генетической информации в нормальной клетке.
- •Клеточный и гуморальный противовирусный иммунитет, их взаимодействие.
- •Принципы культивирования вирусов.
- •Методика титрования и расчёта титра вируса в оое и бое, в единицах 50%-го инфекционного действия.
- •Методы уничтожения, инактивации и консервации вирусов.
- •Механизм персистенции вирусов в клетках.
- •Неспецифические факторы противовирусной защиты организма.
- •Окончательный диагноз на основе обнаружения и идентификации вирусов в организме больных животных.
- •Обнаружение ( индикация) вируса в материале;
- •Особенности противовирусного иммунитета.
- •Открытие вирусов и история их изучения.
- •Патогенез вирусных болезней животных.
- •Персистенция вирусов. Роль факторов иммунитета на этапах патогенеза вирусной болезни.
- •Получение патологического материала, его транспортировка.
- •2.1 Получение и обработка патологического материала
- •2.2 Получение патологоанатомического материала
- •2.3 Получение проб для гистологического исследования.
- •2.4 Транспортировка и хранение проб.
- •Понятие о титре вируса. Единицы количества вируса: оое, бое, лд, ид, элд, эид, цпд, гае. Выражение в них титра вирусов.
- •Понятия о гене и геноме вирусов. Вирусная популяция, вирусный штамм, вирусный клон.
- •Правила работы с вируссодержащими материалами.
- •1.1 Техника безопасности и правила работы с вируссодержащим материалом
- •Получение и транспортировка патологического материала для вирусологических исследований.
- •Устройство вирусологической лаборатории.
- •Превращение вирусологии в одну из фундаментальных биологических наук.
- •Принципы диагностики вирусных болезней животных.
- •Природа вирусов, их место и роль в биосфере. Роль вирусов в эволюции жизни на Земле.
- •Вирусы играют эволюционную роль.
- •Пути проникновения вирусов в организм животного. Первичная локализация и циркуляция вируса.
- •Вторичная циркуляция вируса. Механизм повреждающего действия вирусов на клетки.
- •Полимеразная цепная реакция, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция диффузной преципитации в агаровом геле. Достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реконвалесценция, вирусоносительство и вирусовыделение.
- •Репродукция вирионов вирусов.
- •Реакция иммунной флуоресценции, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция нейтрализации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция непрямой гемагглютинации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Роль вирусов в инфекционной патологии животных, растений и человека.
- •Реакция связывания комплемента, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция торможения гемагглютинации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Использование в вирусологии реакции гемадсорбции.
- •Серологическая диагностика вирусных болезней по приросту титра антител в парных сыворотках крови.
- •Систематика вирусов. Принцип систематики, ее научная и практическая ценность.
- •Основные критерии таксономической классификации вирусов
- •Специфическая профилактика вирусных болезней животных.
- •Специфические факторы противовирусного иммунитета и их формирование.
- •Структура и химический состав вирионов вирусов.
- •Типы вирусных геномов. Структурные (вирионные) и неструктурные белки вирусов, их свойства и отличия от клеточных белков, их функции.
- •Вирусные геномы. Виды вирусных геномов.
- •Трансляция и образование структурных и неструктурных вирусных белков. Сборка вирионов и их выход из клеток.
- •Титрование вирусов.
- •Ферменты вирионов, липиды и углеводы в составе вирионов.
- •3.1. Белки вирусов
- •3.2. Липиды вирусов
- •3.3. Углеводы вирусов
- •Формы взаимодействия вирионов с клетками.
- •Формы и размеры вирионов. Типы симметрии вирионов и их обусловленность. Нуклеиновые кислоты вирусов, их функции и отличия от клеточных нуклеиновых кислот.
- •Экономический ущерб, наносимый животноводству вирусными болезнями животных.
- •Вирусы гриппа птиц и ньюкаслской болезни и их дифференциация в ртга.
- •Вирус африканской чумы однокопытных.
- •Вирус африканской чумы свиней.
- •Вирус болезни Ауески.
- •Вирус болезни Тешена.
- •Вирус инфекционного бронхита кур.
- •Вирус инфекционного бурсита кур.
- •Вирус контагиозного пустулезного дерматита овец и коз.
- •Вирус чумы крупного рогатого скота.
- •1. Определение болезни
- •3. Возбудитель болезни
- •4. Эпизоотология
- •5. Патогенез
- •6.Течение и клиническое проявление
- •7. Патологоанатомические признаки
- •8. Диагностика и дифференциальная диагностика
- •9. Иммунитет, специфическая профилактика
- •10. Профилактика
- •11. Лечение
- •12. Меры борьбы
- •Вирусы гриппа.
- •1. Грипп птиц.
- •2. Грипп свиней.
- •3. Грипп лошадей.
- •Вирусы энцефаломиелитов лошадей.
- •Вирус миксоматоза кроликов.
- •Вирус геморрагической болезни кроликов.
- •Прионы и прионные инфекции животных.
- •6.1. Общая характеристика прионов и прионных инфекций
- •6.1. Основные различия нормальной и патогенной форм прионного белка
- •6.2. Прионные инфекции животных
- •6.3. Скрепи
- •6.4. Энцефалопатия норок
- •Медленные вирусные инфекции.
- •Вирус Алеутской болезни норок.
- •Вирус чумы плотоядных.
- •Вирус инфекционной анемии лошадей.
- •Вирус парагриппа-3.
- •Аденовирусы крупного рогатого скота.
- •Вирусы лейкозов.
- •Вирус болезни Марека.
- •Вирусы респираторно-репродуктивного синдрома свиней и парвовирусной инфекции свиней.
- •Парвовирусная инфекция свиней
- •Вирус бешенства.
- •Лабораторная диагностика бешенства.
- •Лабораторная диагностика лейкоза крс.
- •5.6. Число лейкоцитов и лимфоцитов у здорового, подозрительного по заболеванию и больного лейкозом крупного рогатого скота («лейкозный ключ»)
- •Лабораторная диагностика оспы.
- •Лабораторная диагностика ящура.
Реакция непрямой гемагглютинации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
14.1 Методика постановки РНГА. Она включает: а) приготовление сенсибилизированных эритроцитов (подготовка эритроцитов, их фиксация, танизация и сенсибилизация); б) постановку главного опыта РНГА. Обычно в ветеринарных лабораториях ставят только главный опыт, а сенсибилизированные эритроциты готовят на предприятиях биологической промышленности.
Процесс приготовления сенсибилизированных эритроцитов (эритроцитарного диагностикума):
1) подготовка эритроцитов. Для этой цели наиболее широко применяют эритроциты барана и человека. В настоящее время чаще применяют эритроциты птиц – кур, индеек, уток; приготовленные на них диагностикумы быстрее оседают, что позволяет сократить сроки исследования без потери чувствительности. От соответствующего вида животного берут кровь общепринятым методом. Дефибринированную кровь трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия при центрифугировании;
2) фиксация эритроцитов. Преимущество фиксированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу. Для фиксации эритроцитов чаще всего используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Методики фиксации эритроцитов различны. Одна из них: 50%-ную взвесь отмытых эритроцитов соединяют с равным объемом 50%-ного формалина и после двухчасового контакта при 37 °С с периодическим встряхиванием эритроциты 3 раза отмывают 0,15 M/NaCl (pH 7,2);
3) танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты малоизучен. Однако при этом достигается главное – танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбционной емкостью белков. Танизацию формалинизированных эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов 3%-ной взвеси эритроцитов и раствора танина (1:20000). После 10–15-минутного контакта при 37°С смесь центрифугируют, осадок трехкратно промывают фосфатным буфером (рН 7,2);
4) сенсибилизация эритроцитов. 10%-ную концентрацию эритроцитов на 0,15 М фосфатном буфере (рН 6,4) смешивают с равным объемом вируссодержащей жидкости. Смесь выдерживают 60 мин при 37 °С, периодически встряхивая, затем центрифугируют и 2–3 раза отмывают. Осадок сенсибилизированных эритроцитов разводят до 1%-ной концентрации в фосфатном буферном растворе (рН 7,2), содержащем 1% нормальной кроличьей сыворотки (для стабилизации эритроцитов). Полученные таким образом сенсибилизированные эритроциты используют в РИГА.
Необходимо отметить, что оптимальную сенсибилизирующую дозу антигена (для разных вирусов) подбирают эмпирически в пробных опытах сенсибилизации эритроцитов.
14.2 Главный опыт РНГА. Реакцию ставят в пробирках или в лунках плексигласовых панелей. В последнее время РНГА ставят микрометодом, используя аппарат Такачи (рис. 30), Титертек или автоматические пипетки (1-, 8-, 12-канальные) с изменяющимися объемами (рис. 31). Исследуемые и контрольные сыворотки прогревают при 56 °С 30 мин.
Рисунок 30. Аппарат Такачи
Исследуемую сыворотку разводят двукратно в объеме 0,2 мл физиологическим раствором с рН 7,2–7,4, содержащим 1% нормальной сыворотки кролика, затем к каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл сенсибилизированных антигеном эритроцитов.
Рисунок 31. Многоканальная автоматическая пипетка 1 – регулятор объема; 2– наконечники; 3 – рабочая рукоятка; 4 – сбрасыватель наконечников
Смесь встряхивают и выдерживают при комнатной температуре. Учет проводят через 2–3 ч по осаждению эритроцитов в контроле. Опыт сопровождают следующими контролями: 1) на спонтанную гемагглютинацию эритроцитарного антигена (сенсибилизированные эритроциты + физиологический раствор с 1 % кроличьей сыворотки); 2) на активность сенсибилизированных эритроцитов (сенсибилизированные эритроциты + положительная сыворотка); 3) на специфичность сенсибилизированных эритроцитов(сенсибилизированные эритроциты + нормальная сыворотка или другая негомологичная для данного антигена сыворотка); 4) на отсутствие в сыворотках неспецифических гемагглютининов (исследуемые сыворотки + несенсибилизированные эритроциты).
Результаты реакции оценивают по четырехбалльной шкале: (+++) – агглютинированные эритроциты образуют перевернутый «зонтик» с неровными краями; (++) – по краю агглютинированных эритроцитов намечается тонкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов; (+) – по краю агглютинированных эритроцитов располагается широкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов; (–) – эритроциты оседают на дно в виде диска или колечка – отрицательный результат.
При положительной реакции эритроциты равномерно распределяются по дну пробирки или луночки в виде зонтика, а при отрицательной – оседают в виде компактного осадка или колечка в центре луночки. Достоверные результаты получают при отсутствии гемагглютинации: испытуемой сыворотки с несенсибилизированными эритроцитами, диагностикума с заведомо отрицательной сывороткой, при положительной реакции диагностикума с заведомо положительной сывороткой.
За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее разведение, которое еще вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.
Таким образом, РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи: а) обнаруживать антитела и определять их титр в сыворотках крови. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные вирусом; б) обнаруживать и идентифицировать вирусный антиген. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные антителами.
Достоинства РНГА: высокая чувствительность (по этому показателю она превосходит РДП, РСК и близка к иммуноферментному методу), простота техники постановки и быстрота ответа (через 2– 3 ч). Однако есть и недостатки. Это трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты компонентов, необходимость подбора режима сенсибилизации для каждого вида вируса и т. д.).