Заражение в аллантоисную полость.
Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут:
название вируса
дату
фамилию
Заражение через искусственную воздушную камеру на хао.
Делается отверстие в области воздушной камеры.
Делается окошко «А»
Отсасывается воздух из воздушной камеры.
В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем.
На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия.
Индикация вируса в курином эмбрионе.
Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные.
Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений.
Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины).
Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза.
Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация.
Органы зародыша – некроз, кровоизлияния.
Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур)
Использование культуры клеток.
Культура клеток это клетки многоклеточного организма живущие и размножающиеся в искусственных условиях (in vitro).
Этапы получения первичной культуры.
Берут ткань молодого животного (лучше всего эмбриона).
Кусочки ткани отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса.
Кусочки ткани заливают теплым раствором трипсина.
Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.
Проводят дробную трипсинизацию.
Раствор трипсина сливают в центрифужные пробирки. В растворе находятся отдельные клетки.
Центрифугация в течении 10 минут – 1000 об/мин, затем трипсин сливают.
Клетки помещают в питательную среду:
среда 199
среда Игла
среда гидролизатлактальбумина.
Проводят подсчет клеток в камере Горяева
Клетки разводят питательной средой до посевной концентрации от 500 000 до 1 000 000 клеток на мл.
Добавляют 10% сыворотки КРС.
Разливают в пробирки, матрасы или роллерные колбы и культивируют.
После формирования монослоя (3-5 день) молодую культуру клеток заражают вирусом.
Лучше всего работать с диплоидными культурами клеток, так как как они свободны от контаменантов (бактерии, грибы, микоплазмы)
Используемые растворы.
раствор Хенкса (дистилированная вода, соли, антибиотики)
раствор Эрла (имеет несколько другой солевой состав) Эти растворы используют как солевую базу для отмывания клеток.
Раствор трипсина (0,25%) используют для разделения клеток, для снятия их со стекла.
Раствор Версена используют для снятия клеток со стекла при пересеве.
Используемые среды.
Среда 199 – 20 АМК, более 17 гормонов, всего 69 компонентов.
Среда Игла (Eagle)
Среда ГЛА (гидролизатлактоальбумина.
Заражение культуры клеток.
С выросшего монослоя сливают ростовую питательную среду.
Отмывают клетки от ростовой питательной среды р-ром Хенкса или Эрла.
Заливают вирус содержащий материал 0,1-0,2 мл.
Помещают в термостат (30-60 минут)
Вирус содержащий материал удаляют (не обязательно) и заливают поддерживающую среду.
Зараженную культуру ставят в термостат (37 С) и ежедневно контролируют просматривая под микроскопом.
Методу обнаружения вируса в культуре клеток.
ЦПД – цитопатическое действие.
Гибель клетки с округлением. Округленная клетка слабо прикрепляется к субстрату и выпадает из монослоя, который приобретает вид кружева.
Гибель клетки с фрагментацией.
Образование симпластов.
Адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток.
При проникновении вируса через клеточную оболочку в ней задерживаются вирусные белки и оболочка приобретает свойства белков вируса, а следовательно способность к ГАд.
«РДП. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА МЕОДА, ПОСТАНОВКА И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ. ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ».
РДП в геле основана на способности к диффузии в гелях АТ и растворимых АГ и отсутствие такой способности у комплекса «АГ+АТ». Этот комплекс образуется при контакте диффундирующих навстречу друг другу гомологичных АГ и АТ. Он осаждается на месте образования в толще геля в виде полосы преципитации. В качестве геля используют крахмал, желатин, агар-агар и другое. В лабораторной практике очень часто используют агаровый гель. АТ сыворотки представляют собой молекулы Ig, которые, несмотря на довольно крупные размеры. Способны диффундировать в агаровом геле. АГ вирусов – это вирусные белки. Они могут находится в составе вирионов, представляя так называемые корпускулярные АГ. Крупные размеры которые не позволяют им диффундировать в агаровом геле. Но белки вирусов могут быть и в виде свободных молекул, образующихся в результате деструкции вирионов и (или) разрушения клеток, в которых они образовались. Это растворимые АГ. Они способны к диффузии в агаровом геле. Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублении и в них наливают АГ и сыворотки так. Чтобы АГ и сыворотка были в соседних лунках. Из лунок АГ и сыворотки начинают диффундировать в слой геля. Диффузия направлена во все стороны от каждой лунки. В пространстве между лунками, содержащими АГ и сыворотку, последние диффундируют навстречу друг другу. Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс «АГ+АТ», который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает на месте образования в виде беловатой полосы преципитации. РДП решает задачи: 1) обнаружение в сыворотке крови АТ, гомологичных АГ; 2) обнаружение в материале АГ, гомологичного известным АТ сыворотки;3) идентификация неизвестного вируса; 4) титрование АТ сыворотки. Здесь высшее разведение сыворотки, еще дающее преципитацию с гомологичным АГ, служит показателем титра АТ в сыворотке. РДП часто используют для диагностики лейкоза КРС и инфекционной анемии лошадей. Реакция м\б поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах, капиллярах (редко). Для осуществления РДП на предметных стеклах нужны: обезжиренные предметные стекла, градуированные пипетки (2-5 мл), пастеровские пипетки; трубка диаметром 5мм или штамп, влажная камера, инструмент для извлечения из лунок геля, агар, АГ, сыворотки. Постановка РДП: Предметные стекла кладут на холодную поверхность. Из пипетки наливают агар (слой 1,5-2 мм), дают остыть 5-10 минут. Вырезают лунки, запаивают их. В лунки заливают компоненты РДП, помещают во влажную камеру (где оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат). Препарат РДП на предметных стеклах можно через 48-72 часа высушить и окрасить раствором амидного черного. Это позволяет сохранить препарат неопределенно долго и улучшает возможность фотографировать полосы преципитации. Плюсы РДП: простота техники постановки, быстрота получения ответа, нетребовательность к чистоте компонентов, не требуется стерильной работы, минимальная потребность в компонентах, пригодность для работы с любыми растворимыми АГ, возможность документирования результата путем фотографирования. Минусы РДП: низкая чувствительность. Реакцию ставят для обнаружения в патматериале вирусов бешенства, инфекционного ринотрахеита КРС, африканской чумы свиней, чумы собак, других; А также для идентификации вирусов инфекционной анемии лошадей, аденовирусов, респираторно-синцитиального вируса, вируса диареи КРС, для обнаружения в сыворотках крови АТ к вирусам инфекционной анемии лошадей, респираторно-синцитиального вируса КРС и во многих других случаях.
РТГА И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ. ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ».
Одной из простейших серологических реакции является реакция торможения гемаглютинации. Она основана на том, что АТ при встрече с гомологичным АГ нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, т.к. блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс «АГ+АТ». Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия АТ сыворотки и вируса. РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства двух вирусов. Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток РТГА: возможна только с гемагглютинирующими вирусами.
Принцип титрования АТ в РТГА состоит в следующем: готовят ряд последовательных (обычно 2-х кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл); к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; смеси выдерживают определенное время при определенной температуре, ко всем смесям добавляют равные объемы 1-% суспензии отмытых эритроцитов; после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.
РСК. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА И ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПОНЕНТОВ РЕАКЦИИ».
Реакция связывания комплемента (РСК) — одна из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных болезней. Само название в значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух отдельных этапов. На первом этапе участвуют антиген и антитело (один из этих ингредиентов заранее известен), а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии антигена и антитела их комплекс связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним — гемолизина). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и антитела, то лизиса эритроцитов не происходит (положительная РСК). При отрицательной РСК несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов (рис. 80).
РСК часто используют в диагностической практике для обнаружения и идентификации вирусов, обнаружения и титрования антител в сыворотках крови.
Основными компонентами РСК служат антигены (известные или выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), комплемент, гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют изотонический раствор хлорида натрия (рН 7,2—7,4) или различные буферные растворы. Антигены и сыворотки могут обладать антикомплементарностью, т. е. способностью адсорбировать комплемент, что задерживает гемолиз и искажает результаты реакции. Чтобы избавиться от антикомплементарности, антигены очищают различными методами: ацетоном, фреоном, эфиром, хлороформом и т. д. в зависимости от вида ткани, используемой в качестве антигена и вируса. Сыворотки освобождают от антикомплементарности путем прогревания, обработкой комплемента и другими методами.
Антигены для РСК готовят из органов зараженных животных, из аллантоисной или амниотической жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также из жидкой среды инфицированных культур клеток.
значительно отличается от его подготовки при бактериальных инфекциях. Это обусловлено рядом специфических свойств вирусов.
Во-первых, для освобождения вирусного антигена из клетки приходится часто дополнительно обрабатывать инфекционный материал с целью разрушения клеток и освобождения антигена.
Во-вторых, большой термолабильностью вирусных антигенов по сравнению с бактериальными. У большинства вирусов комплементфиксирующий антиген связан с инфекционной частицей, и разрушение его идет параллельно с потерей инфекционное™. Поэтому материалы для получения антигена необходимо брать от павших животных только в первые часы после гибели их, а лучше при жизни. Консервирование вируссодержащего материала различными дезинфицирующими средствами часто не дает положительных результатов, так как многие из них вызывают разрушение вирусного антигена.
В-третьих, неравномерностью фиксации комплемента при различном ношениях их; при избытке антител фиксация комплемента резко снижается, так как активный комплекс антиген + антитело представлен в основном в форме антител и активная поверхность комплемента незначительна. То же самое наблюдается и в зоне избытка антигена, где подавление фиксации комплемента происходит еще быстрее. Поэтому для установления оптимальной зоны фиксации комплемента необходимо предварительное титрование антигена и антител.
В-четвертых, незначительным объемом комплекса антиген + антитело. Размер вирусных частиц, вступающих в комплекс, очень ничтожен, и поэтому площадь фиксации комплемента незначительна. С увеличением объема комплекса антиген + антитело путем удлинения периода фиксации комплемента (до 18ч при 4 °С) повышается чувствительность реакции, но снижается ее специфичность, так как при продолжительном периоде фиксации увеличивается фиксация комплемента неспецифическими антигенами (тканевыми).
И наконец, в-пятых, высокой прокомплементарной активностью вирусного антигена. Для исключения неспецифической фиксации комплемента необходима более полная очистка вирусного антигена от тканевых фрагментов.
Большой помехой для использования РСК в диагностике вирусных болезней животных и человека является неравномерное накопление вирусного антигена в различные периоды болезни и особенно при разных инфекциях.
РСК применяют для определения типов и подтипов (вариантов) вируса ящура, вызывающих заболевание животных, для проверки производственных штаммов вируса ящура при изготовлении вакцин и лабораторных штаммов в научно-исследовательской работе.
Гемадсорбция – соед. эр. с повержностью пораженных вирусом кл. В основе этого явления сродство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной кл., с рецепторами эритроцитов, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество реакции сост. втом, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитоплазматических изменений. Она может использована для обнаружения и титрования вирусов путем заражения культуры ткани вирусом в разл. разведениях. Использ. для выделения и идентификации парагриппозных вирусов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
ПЦР является наиболее чувствительным методом. Реакция обнаруживает вирусные НК. Реакция открыта в 1985 году в США.
Сутью метода является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекул ДНК in vitro. ПЦР основана на амплификации ДНК при помощи ДНК-полимеразы, которая осуществляет синтез взаимокомплементарных цепей ДНК начиная с 2-х праймеров (затравок)
Primer – фрагмент ДНК из 20-30 нуклеотидов. Синтезированный искусственно. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК. Обычно при ПЦР ставят от 25 до 40 циклов в зависимости от возбудителя. Каждый цикл состоит из трех этапов.
Денатурация. 92-95 градусов С, 20-60 секунд. Происходит разрыв водородных связей цепей ДНК.
Отжиг – присоединение праймеров. 50-60 градусов С, 40-60 секунд. Происходит забрасывание праймеров, нуклеотидов и ДНК-полимеразы.
Элонгация – достраивание цепей ДНК. 68-72 градуса С, 40-60 секунд. Число цепочек ДНК удваивается. Образовавшиеся в первом цикле цепочки ДНК служат матрицами для последующих циклов и т.д. Таким образом в каждом цикле идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать 225-240 участков ДНК, что позволяет обнаружить их методом электрофореза.
В ПЦР используют праймеры из консервативных участков ДНК вируса, которые имеют уникальную последовательность для каждого возбудителя.
Методика постановки.
Из исследуемого материала выделяют НК, которую помещают в чистую пробирку и добавляют амплифицирующую смесь, которая состоит из:
Буфера
ДНК-полимеразы
Раствора 2-х видов праимеров
4-х видов нуклеотидов
Магний-хлорного катализатора
Крезолового красного для визуальной оценки
Доливают деионизированной воды.
Сверху капают минеральное масло.
Пробирки помещают в програмируемый термостат-амплификатор и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе для соответствующего вида возбудителя (2-3 часа). Одновременно ставят положительный и отрицательный контроль.
Регистрация результатов – детекция амплификонов. Проводят методом электрофореза в 1-2% агаровом геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и высвечивается в виде полосок при УФО (трансилюминатор).
ПЦР,ее принцип,практ исп-ие,дост и недост.
Не серолог. р-ция,напр-на на обнар-ие вир-й нукл-й к-ты(генома). Принцип:у выд-й из пат мат вир-й нукл к-ты многократно воспроизводят(копируют) опред-й наиболее консервативный уч-к «in vitro», а затем его идентифицируют.У больш-ва вир-в нукл к-ты расшифрованы (послед-ть нуклеотидов)-около 500 пар нуклеотидов-участки, специф-ие для опред. типа вируса.Эти уч-ки наз-ся ампликоны. Их надо многократно воспроизвести.
3 этапа 1 цикла ПЦР(надо 25-40)- амплификация;
1)Денатурация: нагревают до 90-92С в теч 1мин (чтобы разорвать водород.цепь) 2)Отжиг (гибридизация): смесь охлаждают до 58-62С в теч 1мин(чтобы специф-ие праймеры присоед. к противоп-м концам ампликона по принципу комплементарности).Праймеры комплем-ны концам амп-а 3)Элонгация:нагрев до 68-72С 1мин-в присутствии фермента ДНК-полимеразы нуклеотиды синтез-т дочернюю цепь, комплементарную матрице начиная с праймеров от 3/ к 5/ (достраив-ся за 3 мин).
Методика ПЦР: 1ст:Пробоподготовка-выделение из пат мат суммарной ДНК 2ст:Амплификация
реакционная смесь(минер масло+ионы магния+суммарная ДНК+фермент+ нуклеотиды+2вида праймеров) =>помещают в амплификатор(амплификация)-прох-т циклы ПЦР.
3ст:выдел.ампликонов методом электрофареза в агарозе:м/ду пластм-ми зал-т агарозу,и пока она не заст вставл гребенку =>образ-ся корманы.Затем добавл флуоресц-ое в-во и помещ в УФ(трансиллюминатор)-свечение.
Бешенство.
1. Сем.: рабдовирусы (греч. рабдос - стержень, палочка).
2. Вирус - РНК-содержащий, пулевидной формы, длина 180 нм. толщина - 70-80 нм, спиральный тип укладки, имеет наружную оболочку с булавовидными выпячиваниями, гемагглютининов нет. Нейротропный; вирус имеет 4 серотипа.
3. Болеют все млекопитающие, чувствительны и птицы, но в значительно меньшей степени. Болеет человек. Болезнь распространена на всех континентах. Домашние животные чаще всего заражаются при покусах больными дикими животными (лисами, волками и др.). Болезнь почти всегда кончается смертельно.
Клинические симптомы бешенства у всех животных сходны и характеризуются поражениями центральной нервной системы (у собак бывает буйная или тихая паралитическая форма). От места внедрения (обычно укуса) вирус движется к головному мозгу по нервным стволам. Это движение занимает от 10 дн. до нескольких месяцев в зависимости от места внедрения, чем определяется большой инкубационный период.
Вирус размножается в головном мозгу, при этом поражаются нейроны и вызывают клиническую картину бешенства.
Патологоанатомические изменения при бешенстве неспецифичны.
4. Заподозрить бешенство можно по клиническим признакам при вероятности наличия бешенства на этой территории (эпизоотологичес-кие данные).
Окончательный диагноз на бешенство может быть поставлен только на основании лабораторных исследований материала от больного животного (посмертно). Материал для исследования; голова павшего животного, а в случае, если животное мелкое, - труп целиком.
Экспресс-метод - обнаружение вирусного антигена с помощью РИФ, РДП, а также телец Бабеша-Негри в различных отделах головного мозга (аммонов рог. кора полушарий, мозжечок и продолговатый мозг) павших
животных.
Вирусологические методы. При отрицательных результатах экспресс-метода ставят биопробу на молодых мышатах (заражают интрацеребрально не менее 12 мышей), результат учитывают путем исследования мозга павших мышей в РИФ, РДП и по обнаружению телец Бабеша-Негри.
5. Иммунитет. Механизм поствакцинального иммунитета окончательно не расшифрован. Имеют значение вируснейтрализующие антитела в крови, особенно в ликворе, устойчивость клеток мозга к виpycy. Для специфической профилактики бешенства используют живые и инактивированные вакцины, которые можно применять даже сразу после заражения, учитывая большой инкубационный период. Исполъзуют следующие вакцины: сухая антирабическая фенолвакцина. антирабическая АзВИ, антирабическая этанолвакцина.
антирабическая инактивированная сухая вакцина из шт, "Щелково -51", выращенная в КК ВНК-21.
Болезнь Ауески.
1. Сем.: герпесвирусы (герпес - ползучий).
2. Вирус - ДНК-содержащий, размеры - до 150 нм, имеет супер-капсид (чувствителен к эфиру). Не обладает гемагглютинирующей способностью. Репродукция в ядре и цитоплазме. Пантропный; антигенных вариантов не установлено.
Вирус устойчив во внешней среде; при +1...-4 °С сохраняется до 3-4 лет, в насыщенном растворе поваренной соли - до 3 мес.
3. Болеют все виды животных, но обычно - поросята. Встречается болезнь повсеместно. Заражение происходит через корм и воду, но возможно через слизистые оболочки дыхательных путей и поврежденную кожу. Распространяется крысами.
Болезнь Ауески - острая вирусная болезнь животных и человека, характеризующаяся признаками поражения ЦНС, органов дыхания и характерными расчесами в местах проникновения возбудителя (у свиней зуда не бывает). У поросят, кроме того. может быть ринит; конъюнктивит, кашель.
Взрослые свиньи персболевают легко, а поросята 3-5-мссячного возраста погибают на 70-100 %.
Вирусоносительство у свиней - до 300 дн. Патологические изменения выражаются в катаральной пневмонии, гастроэнтерите, очагами некроза в печени и селезенке.
4. Заподозрить болезнь Ауески можно по характерным клиническим симптомам и патологоанатомическим изменениям (клинико-эпизо-отологическая и патологоанатомическая диагностика).
Материал для исследования: смывы из носовой полости и кровь (лучше парные сыворотки), от трупов - кусочки головного мозга, легких,печени, селезенки.
Экспресс-метод - обнаружение вирусного антигена в РИФ. Вирусологический метод: а) выделение вируса на культуре клеток почек поросят: б) биопроба на кроликах (характерны зуд и расчесы в месте заражения).
Идентификация: РИФ, РН.
Ретроспективная диагностика: по приросту титра антител в парных выворотках.
Следует дифференцировать болезнь Ауески от бешенства, чумы свиней, гриппа, рожи, отравления поваренной солью.
5. Иммунитет. После переболевания - пожизненный. Применяют живые вакцины ВГНКИ и из штамма БУК-628.
Чума КРС.
1. Сем.: парамиксовирусы.
2. Вирус - РНК-содержащий, со спиральным типом симметрии, размер вируса - 86-126 нм. Он представляет собой частицу различной формы и размера, что указывает на полиморфизм. Большинство частиц имеет округлую или овальную, иногда нитчатую форму. Инфекционный вирион содержит преципитирующий, комплементфиксирующий и гемаг-глютинирующий антиген.
Вирус нестоек и легко разрушается под влиянием различных физических факторов.
3. Заболевание сопровождается признаками септицемии, лихорадкой, катарально-геморрагическим и крупозно-дифтерическим воспалением слизистых оболочек, в основном ЖКТ. Инкубационный период длится 6 дн.
Животные быстро худеют, скрежещут зубами, мотают головой. Характерные признаки заражения - тусклый взгляд, гнойный секрет из глаз, грязные носовые истечения, пенистая слюна в углах рта. ускоренное, затрудненное, со стонами дыхание, жидкие испражнения. Большинство животных погибает. Патологоанатомические изменения: признаки воспаления слизистой оболочки пищеварительного тракта (кровоизлияния, изъязвления). Наиболее характерные признаки; геморрагическое воспаление в области илиоцекального клапана, желчного и мочевого пузыря; кровоизлияние на эпикарде и особенно на эндокарде; пневмония или эмфизема легких.
4. Диагноз ставится на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных, а также по результатам лабораторных исследований и биопробы на восприимчивых животных.
Лабораторная диагностика предусматривает: выделение вируса в культуре клеток и идентификация его в РН, обнаружение вирусного антигена в органах от павших или вынужденно убитых животных в РСК, РДП, РНТГА, РНГА, РИФ, ИФА. Обнаружение, специфических антител у переболевших животных в РСК, РН, РДП, РТГА, ИФА.
Материал для выделения вируса берут от больных (кровь, пунктат лимфатических узлов) или убитых и павших животных (предлопаточные, мезентериальные, лимфатические узлы, селезенка). Для экспресс-диагностики разработана РТГА. Для исследования мазков-отпечатков,гистологических срезов используют РИФ.
Для выделения вируса используют культуру клеток почки телят, которую после удаления ростовой среды заражают, нанося на слой клеток суспензию лейкоцитов исследуемого животного или суспензию его органов. За культурой наблюдают 9-18 дн. На положительный результат
указывает ЦПЭ, который характеризустся появлением округлившихся клеток, возникновением многоядерных синтициев и распадом слоя
культуры. При отсутствии ЦПЭ делают слепой пассаж. Идентификацию проводят при помощи РН. Для постановки биопробы используют телят, которых заражают кровью или 10-20%-ной суспензией лимфатических узлов, полученной от больных животных в первые 5 дн. после заболевания.
5. В нашей стране инфекция не регистрируется. Переболевшие и вакцинированные животные приобретают стойкий иммунитет. Молодняк от переболевших животных имеет колостральный иммунитет, для профилактики применяют сухую культуральную вирус-вакцину.
. Ящур.
1. Сем.: пикорнавирусы (пико - маленький).
2. Вирус - РНК-содержащий; размер - от 20 до 25 нм, шарообразной формы, вирусы не имеют суперкапсидной оболочки, нечувствительны
к эфиру, репродукция в цитоплазме, дерматропный (эпителиотропный); установлено семь серотипов: А, О. С, Сат-1. 2, 3, Азия-1.
Все типы имеют варианты. В нашей стране регистрируются два
типа - А и О. Гемагглютинины отсутствуют. Вирус очень устойчив во
внешней среде.
3. Болеют все парнокопытные, но чаще всего крупный рогатый скот, реже - свиньи и еще реже - овцы, болеет и человек. Лошади невосприимчивы Болезнь передается любыми путями, очень быстро распространяется в стаде и по территории.
Ящур - острая вирусная, чрезвычайно контагиозная болезнь. проявляется лихорадкой, афтозными (пузырьки с серозным содержимым) поражениями ротовой полости, конечностей и других участков тела.
Взрослые животные не погибают; телята, поросята погибают в 40-60 % случаев. Большой экономический ущерб обусловлен снижением молочной и мясной продуктивности, а также расходами на проведение противоэпизоотических мероприятий.
4 Диагностика ящура основана на эпизоотологических данных, клинических признаках болезни, патологоанатомических изменениях и лабораторных исследованиях.
Материал для исследования: стенки и содержимое афт; от павшего молодняка - кусочки сердечной мышцы.
Экспресс-метод. Постановка РСК с целью определения вида вируса
и его серотипа.
Вирусологические методы:
а) выделение вируса проводится в результате заражения:
естественно-восприимчивых животных (КРС, свиньи, овцы);
лабораторных животных (мышата-сосуны, морские свинки, крольчата);
КК (клетки свиной почки, щитовидной железы);
б) идентификация:
постановка РСК с целью подтверждения выделенного вируса ящура и его серотипа.
5. Иммунитет непрочный. Переболевание одним типом (даже подтипом) не создает восприимчивость к другому (антигенная вариабельность).
Для специфической профилактики применяют инактивированные вакцины с гидроокисью алюминия (ГОА) различной валентности: одновалентная А-48, бивалентная А, О, трехвалентная А-О-А-48, О, А, С.
. Ринотрахеит КРС.
1. Сем.: герпесвирусы.
2. Вирус - ДНК-содержащий. Вирион размером 150-200 нм, состоит из капсида кубической симметрии и покрывающей его внешней оболочки; существуют антигенные варианты; имеет гемагглютинины, устойчив к влиянию физических и химических факторов.
3. Восприимчив к заболеванию только КРС, молодые животные более восприимчивы и болеют тяжелее. В зависимости от локализации вирусов, степени его вирулентности, возраста, пола и физического состояния животного наблюдают разные по длительности скрытые периоды и формы проявления болезни. Инкубационный период длится обычно 2-10 дн. Наиболее часто встречается респираторная форма болезни, отмечается генитальная, менингоэнцефалитная и неонатальная формы. Патологоанатомические изменения зависят от формы болезни.
4. От больных животных берут 15-20 проб: смывы со слизистой оболочки носовой полости, глаз, влагалища, препуция, пробы спермы.От убитых с диагностической целью животных берут кусочки легких с бронхом; селезенку; лимфоузлы; миндалины; пораженные участки слизистых оболочек носовой и ротовой полостей, трахеи, ЖКТ, пробу крови; от абортированных плодов - кусочки паренхиматозных органов.
В ядрах клеток эпителия пораженных слизистых оболочек находят специфические тельца-включения.
Диагноз основан на анализе эпизоотологических, клинических даных, патологоанатомических изменений, выделений и идентификации вируса в культуре клеток бычьего происхождения овец, свиней, кроликов, особенно хорошо - в культуре клеток почки эмбриона коровы и тестикул бычка, а также на обнаружении антител в сыворотке крови и носовых смывах. Диагноз также ставят с помощью серологических реакций, РН в культуре клеток, РНГА, РСК и метода ELISA. Для экспресс-диагностики используют методы иммунофлуоресценции, электронномикроскопический. При ретроспективной диагностике пользуют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 3 нед, антитела обнаруживают в РН, РНГА и других серологических реакциях. Заражение животных производят очень редко, иногда используют телят 6-8 мес, вводя патматериал им интраназально, интравагинально, подкожно или наносят на конъюнктиву.
5. У переболевших животных иммунитет длится не менее 1,5-2 лет, они являются пожизненными вирусоносителями. Для профилакти применяют живые и инактивированные вакцины, гипериммунные сыворотки реконвалесцентов.
. Чума плотоядных.
1. Сем. парамиксовирусы.
2. Вирус в естественных условиях слабоустойчив. При температуре -10С1С он выживает в течение нескольких месяцев, при температуре -76 С- неограниченное время. В организме больньгх животньгх вирус в высоких титрах находят в экскрете из носовой полости, в крови, селезенке, костном мозге, лимфоузлах, в экссудатах грудной и брюшной полостей. Вирус обладает гемаггютинируюищим свойством. Размер вирионов - 115-160 нм. Вирус имеет преципитируюший, гемагглютинирующий и комплементсвязывающий антигены.
3. Чума плотоядных (болезнь Карре) - остропротекающая контагиозная болезнь собак, волков, лисиц, шакалов, норок, соболей, енотов, хорьков и других плотоядных, характеризующаяся лихорадкой, острым катаром слизистых оболочек, пневмониями, кожной экзантемой и поражением нервной системы. Распространена повсеместно. Инкубационный период - от нескольких дней до 3 нед. Снмнтомы: повышается температура тела до 39-40|)С: при легочной форме развивается ринит; при кишечной форме чумы наблюдают рвоту, запоры, сменяющиеся поносом, при кожной форме на бесшерстных участках кожи живота и бедер появляется пустулезная сыпь; при нервной форме наблюдается угнетение, пугливость, раздражительность, клонические судороги мышц, могут быть и параличи.
При вскрытии наблюдают мелкие кровоизлияния в сердечной мышце. Слизистая оболочка дыхательных путей гиперемирована, покрыта слизисто-гнойным экссудатом, легкие имеют уплотненные участки. Слизистая оболочка желудка и кишечника катарально воспалена, с кровоизлияниями и язвочками. Увеличены брыжеечные лимфатические узлы. Селезенка - без изменений или слегка увеличена. Наблюдают точечные кровоизлияния на слизистой оболочке мочевого пузыря, Вещество головного мозга отечно, количество субдуральной жидкости повышено.
4. Многообразие симптомов затрудняет диагностику. Диагноз на чуму плотоядных ставят комплексно: на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных и лабораторных исследований.
В лабораторию направляют кровь для ретроспективной диагностики, секреты: носовые, конъюнктиву, слюну, фекалии для вирусологических исследований. Посмертно: мозг, кусочки селезенки, печени, их применяют в качестве антигена в серологических реакциях.
Экспресс-методы - РИФ, РСК, РГА, РЗГА, тельца-включения.
Вирусологические методы: выделение вируса (культура клеток, КЭ, лабораторные животные); идентификация вируса (РН, РДП, РСК).Ретроспективные методы - РСК, РЗГА.
5. У переболевших животных наступает практически пожизненный иммунитет. Щенята от иммунных матерей, а также подсосные щенята невосприимчивы в течение 2-3 мес. Для профилактики чумы плотоядных применяют сухие культуральные вирус-вакцины из аттенуированных штаммов 668-КФ, ЭПМ, ВАКЧУМ.
Аденовирус КРС.
1. Сем.: аденовирусы.
2. Вирус - РНК-содержащий: имеет капсид двадцатигранной формы, состоящий из капсомеров; размер вируса - около 70-90 нм; он обладает гемагглютининами; имеются антигенные разновидности; цито-патогенный вирус; довольно устойчив к физическим и химическим факторам.
3. Болеет КРС, чаще всего телята от 2-недельного до 1-4-месячного возраста, инфекция широко распространена во многих странах; поражаются органы дыхания, пищеварения и зрения: повышение температуры тела достигает 41,5°С, характерны слезотечение, серозное истечение из носа, кашель, затрудненное дыхание, тимпания, колики, диарея.
Патологоанатоминеские изменения с признаками геморрагического катарального гастроэнтерита, очагового уплотнения, ателектаза, эмфиземы легких.
В результате исследований в эндотелиальных клетках сосудов печени, почек, селезенки, слизистой оболочки желудка и кишечника находят внутриядерные включения.
4. Диагноз основан на анализе эпизоотологических, клинических. патологоанатомических изменений и результатов лабораторных измерений.
Взятие патматериала происходит так же, как при инфекционном ринотрахеите. Лабораторная диагностика включает обнаружение антител в патологоанатомическом материале (мазках-отпечатках, срезах), полученном от больных животных, в РИФ и РСК; выделение возбудителя из патологического материала в культуре клеток тестикул бычка (ТБ), ПЭК или ЛЭК и его групповая идентификация в серологических акциях: РСК, РДП и РИФ; выявление антител в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в серологических реакциях: РСК, РНГА, РДП.
5. Переболевшие и вакцинированные телята приобретают иммунитет к заражению вирусом гомологичного типа. Пассивный иммунитет создают аденовирусные антитела молозива матери. Применяется инактированная вакцина из штаммов двух серологических групп аденовирусов.
. Диарея КРС.
1. Сем.: тогавирусы.
2. Вирус содержит однонитчатую линейную инфекционную РНК. Вирион и нуклеокапсид имеют сферическую форму. Капсид покрыт наружной липопротеидной оболочной. Размер вириона - от 20 до 50 нм. Гемагглютинирующие и гемадсорбирующис свойства не установлены, антигенная структура не изучена. Вирус устойчив к физическим и менee - к химическим факторам.
3. Болеют КРС, буйволы, олени, косули. Наиболее восприимчивы животные в возрасте от 6 мес до 2 лет. Болезнь характеризуется воспалением и изъязвлением слизистых оболочек пищеварительного тракта и сопровождается ринитом, лихорадкой, диареей, иногда хромотой; повсеместно распространена.
Характерны следующие патологоанатомические изменения: геморрагии, гиперемия, отек, эрозии и язвы слизистых оболочек, пищеварительного тракта. Возможны некрозы слизистых пищевода, тонких кишок и сычуга.
4. Предварительный диагноз ставят на основании положительных результатов обнаружения антигена в патологическом материале методом иммунофлуоресценции с учетом эпизоотологических данных, а также патологоанатомических изменений.
Патматернал от больных животных - смывы со слизистой оболочки носа, пробы крови, соскобы с пораженных участков слизистой от животных, убитых с диагностической целью, - кусочки легких, селезенка, лимфоузлы, пораженные участки слизистой, кровь.
Вирус диареи выделяют в культурах клеток эмбриона КРС. Изолят считается выделенным в случае, если он вызывает стабильное ЦПД не менее чем в двух последовательных пассажах.
Биопробы на телятах ставят в тех случаях, когда попытки выделить вирус оказались безуспешными или возникает сомнение в связи с тем, что в зараженных культурах клеток нет ЦПД. В качестве материала для заражения используют культуральную жидкость 3-5 пассажей. 5-10 мл которой вводят внутривенно.
Основной метод идентификации - РН. Иммуноферментный метод позволяет легко идентифицировать культуры клеток, инфицированных вирусом диареи. Диагноз на прошедшую инфекцию, а также на латентное вирусоносительство обычно ставят при помощи РН в культуре клеток, определяя титры антител в сыворотках реконвалесцентов.
5. Иммунитет изучен недостаточно. Телята-реконвалесценты сохраняют резистентность к повторному заражению от 12-16 мес до 3-5 лет. Применяют живую и убитую вакцину.