1. Нуклеиновые кислоты вирусов.

Главной структурной особенностью большинства вирусных молекул ДНК, как и ДНК из других источников, является наличие двух спаренных антипараллельных цепей. ДНК-геном вирусов, однако, невелик и поэтому здесь возникают вопросы, касающиеся концов спирали и общей формы молекулы ДНК, а не монотонной, фактически не имеющей концов «средней» части спирали. Полученные ответы оказались весьма удивительными: молекулы вирусных ДНК могут быть линейными или кольцевыми, двухцепочечными или одноцепочечными по всей своей длине или же одноцепочечными только на концах. Кроме того, выяснилось, что большинство нуклеотидных последовательностей в вирусном геноме встречается лишь по одному разу, однако на концах могут находиться повторяющиеся, или избыточные участки.

Помимо очень интересных различий в форме молекулы и в структуре концевых участков вирусных ДНК существуют также большие различия в величине генома. В 1953 г. Уайетт и Коэн сделали неожиданное открытие, весьма существенное для последующих экспериментов: оказалось, что в ДНК бактериофагов содержится не цитозин, а 5-гидроксиметилцитозин. Это отличие дало возможность изучать фаговые ДНК независимо от ДНК хозяина. Были открыты кодируемые фагом ферменты, которые изменяют метаболизм инфицированной клетки, и она начинает синтезировать компоненты, необходимые вирусу. Еще одно биохимическое отличие ДНК бактериофага состоит в том, что к ее гидроксиметилцитозину присоединены остатки глюкозы: последние, видимо, препятствуют прерыванию фаговой ДНК некоторыми ферментами хозяина.

В противоположность этому у вирусов животных ДНК почти не подвергается модификациям. Например, хотя ДНК клеток-хозяев и содержит много метилированных оснований, у вирусов имеется в лучшем случае лишь несколько метильных групп на геном. Большинство вирусных дезоксинуклеотидов не модифицированы, и поэтому нахождение несомненных модификаций представляло бы большой интерес.

Исследования вирусной РНК составили один из самых значительных вкладов вирусологии в молекулярную биологию. Тот факт, что у вирусов растений реплицируемая генетическая система состоит только из РНК, ясно показал, что и РНК способна сохранять генетическую информацию. Была установлена инфекционность РНК вируса табачной мозаики, и выяснилось, что для инфекции необходима вся ее молекула; это означало, что интактность структуры высокомолекулярной РНК существенно для ее активности. Размеры вирионов РНК - вирусов сильно варьируются, однако размеры РНК и, следовательно, объем содержащейся в ней информации различаются в значительно меньшей степени.

РНК пикорнавирусов - вероятно, наименьшая из известных - содержит около 7500 нуклеотидов, а РНК парамиксовирусов - едва ли не самая крупная - почти 15000 нуклеотидов. По-видимому, всем независимо реплицирующимся РНК-вирусам нужен какой-то минимум информации для репликационной системы и капсидного белка, но у них отсутствует очень сложная добавочная информация, которой могут обладать крупные ДНК-вирусы.

Принцип систематики вир,осн систематич-ие группы и их номенклатура.

Вир классиф-ся по:

1)Тип нукл к-ты (ДНК или РНК) и ее стр-ра(кол-во и форма цепей)

2)Стратегия вир-го генома

3)Размер и морфология вириона(тип симметрии, число капсомеров)

4)Ф-х св-ва(уст-ть к темпер-ам,рН, жиро-раств и тд)

5)Наличие липопрот обол-ки

6)Антигенные св-ва

7)Патогенность,в тч цитопатич-ие измен-ия в кл-ах и внутриклет вкл-ия

8)Круг воспр-х хозяев

9)Способ передачи

10)Географич-ое распростр-ие

Таксоны вирусов

Отряд(3)

Семейство(56)

Подсем-во(9)

Род(233)

Вид(1550)(Мб уровни: серотип, вириант,штамм,изолят)

Семействава

1)ДНК-двухспир-ая линейная

-Poxviridae

-Iridoviridae

- Herpesviridae

-Adenoviridae

2)ДНК-двухспиральн циркулярная

-Asfaviridae

-Polyamaviridae

-Papillomaviridae

-Hepadnoviridae

3)ДНК-односпир циркул-ая

-Parvoviridae

-Circoviridae

4)РНК- одоспир линейная +нитевая

-Picornaviridae

-Caliciviridae

-Astroviridae

-Coronoviridae

-Arteriviridae

-Flaviviridae

-Togaviridae

-Retroviridae

5) РНК- одоспир линейная –нитевая

-Bornaviridae

-Eiboviridae

-Paramixoviridae

-Rhabdoviridae

6)РНК-односпир сегментр-ая –нитевая

-Ortomyxoviridae

-Bunyaviridae

-Arenaviridae

7) РНК-односпир сегментр-ая +нитевая

-Nodaviridae

8)РНК-односпир циркул-ая +нитевая

-род Detavirus

9)РНК-двухцепоч-ая сегментир

-Reoviridae

-Birnaviridae

Репродукция вирионов вир.

Этапы взаимодействия вируса с клеткой.

Репродукция-воспроизведение вирусом себе подобных частиц.

I фаза

1. Адсорбция вириона на поверхности клетки(прикрепление).

• это происходит спонтанно и не специфически за счет электро-статического притяжения аминных групп вируса (+) и кислофосфатных групп клетки (-).

• Специфический механизм, за счет комплементарных связей клеточных и вирусных рецепторов (липопро-теиновых и мукопротеиновых).

2. Проникновение вируса в клетку – виропексис. Происходит пиноцитоз, т.е. вирус адсорбируется на клеточ-ной стенке, образуется впячивание, и вирус проникает в клетку в виде пиноцитозного пузырька. Так же проникновение происходит путем сплавления, когда вирус проникает из одной клетки в другую не выходя в межклеточное пространство. Этот путь характерен для герпетических инфекций.

3. Депротеинизация вируса(раздев-е) – высвобождение вирусного генома. Удаляется вир-ая защ-ая оболочка. Вирусная частица частично разбирается на отдельные капсоме-ры.Освоб-ся нукл к-та.

II фаза

1. Транскрипция: перепис-ся инф с вир нукл к-ты на иРНК по законам генетич-го кода(принцип комплем-ти),а с иРНК на белок..

2. Трансляция иРНК: процесс перевода ген-й инф,сод. В иРНК на специф послед-ть аминок-ты.Синтез вир белков в кл-ке(на рибосомах)

1ф-инициация: рибосома узнает иРНК, связ-ся с особым уч-м и достигает инициат-го кодона,с кот нач-ся трансляция(АУГ)

2ф-элонгация: удлинение(наращ-ие) полипепт цепи(присоед-ся новые аминок-ты с пом пептидных связей)

3ф-терминация: 1)иРНК в гигантские полипепт-предшеств,кот нарезаются на зрелые белки;2)иРНК транслир с образ зрелых белков

3.Репликация вирусной нукл к-ты,гомолог геному. Одновр на обоих цепях=>образ из 1 родит и 1новой цепи

4.Синтез вирусных структурных «поздних» белков.

5.Сборка вируса – ассамблирование

• образование нуклеокапсидов

• организация вирусной мембраны.

6. Выход зрелых вирусных частиц за пределы клетки:1)путем взрыва-у вир,не имеющего суперкапс об-ки;2) почкование(вир с суперкапс об кл-ки способен сохр св жизнеспос-тьпока не исп-ет свои ресурсы)

«ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА ДНК-СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ. ПОНЯТИЕ ТРАНСКРИПЦИИ И ТРАНСЛЯЦИИ».

Транскрипция - переписывание ДНК на РНК – осуществляется с помощью фермента РНК-полимеразы, продуктами является биосинтез и-РНК. ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происходит в ядре, используют для транскрипции клеточную полимеразу. РНК-содержащие вирусы ф-ю и-РНК выолняет сам геном. У некоторых РНК-содержащих вирусов передача генетической информации осуществляется по формуле РНК-РНК-белок. К этой группе вирусов относятся – пикорновирусы, корновирусы.

У РНК-содержащих вирусов транскрипция осуществляется вирусоспецифическими ферментами транскриптазами, т.е. вирусами закодированными в геноме.

Синтез белка происходит в результате трансляции в РНК.

Трансляция – процесс перевода генетической информации, содержащейся в вирусе на специфическую последовательность АК. Синтез белка осуществляется на рибосомах клетки. Репликация – синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичной геному. В клетке происходит репликация ДНК в результате которой образуется двунитчатая ДНК. Будучи внутриклеточными паразитами вирусы используют все энергетические ресурсы клетки для синтеза компонентов: АК, нуклеотидов, АТФ. При этом в значительной мере или полностью подавляется клеточный метаболизм. На ряду с этим вирус вызывает образование ферментов, отсутствующих в клетке и необходимых для репликации вирусных АК.

Под воздействием ферментов у ДНК-содержащих вирусов осуществляется синтез и-РНК, и-РНК посылается на рибосомы чувствительной клетки. На рибосомах клетки начинается синтез ранних вирионных белков (наделены свойствами – ферментами, блокируют клеточный метаболизм).

Ранние вирионные белки дают начало образованию ранних вирионных кислот.

По мере накопления ранних вирионных белков они блокируют себя и процесс перестраивается на рибосомном аппарате. Идет сборка вирионов и вновь сформировавшиеся вирионы покидают клетку-мать.

«ПАТОГЕНЕЗ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Тропизм – склонность вируса к тому или иному вороту инфекции. При респираторных инфекциях – вирус локализуется в носоглотке, трахее и легких; при энтеровирусных – в кале; при нейротропных – в ГМ или СМ; при дермотропных – в коже.

Патогенез вирусных инфекций.

Под патогенезом понимают совокупность процессов, вызывающих заболевание, его развитие и исход.

Патогенез определяется:

1.Тропизмом вируса

2.Количеством инфекционных частиц

3.Реакцией клетки на инфекцию.

4.Реакция организма на изменение клеток и тканей.

5.Скоростью репродукции.

В основе тропизма вирусов лежит чувствительность к вирусу определенных клеток.

Патогенез обусловлен основными механизмами взаимодействия вирусов с клетками:

- атрофия или дистрофия (ЦПД)

- образование телец включений

- образование симпластов и синцитиев

- трансформация

- латентная (хроническая) инфекция.

Под инфекцией понимают состояние зараженности макроорганизма. Это комплекс процессов, происходящих при взаимодействии инфекционного агента с организмом хозяина. В связи с тем, что вирусы являются внутриклеточными паразитами в основе их взаимодействия с организмом всегда лежит инфекционный процесс на уровне клетки, который реализуется путем взаимодействия вирусного и клеточного генома, поэтому возможно классифицировать инфекцию как на клеточном, так и на организменном уровне.

Патогенез на клеточном уровне – сюда входит ЦПД (видимые морфологические изменения клеток под воздействием того или иного вирусного агента). Характер ЦПД различен и зависит от:

1.Вида клетки

2.Биохимических свойств вируса

3.Заражающей дозы

Характер ЦПД оценивается по 4-х бальной системе крестовой и учитываются изменения, когда используются культуры клеток для титрования (т.е.).

Патогенез на организменном уровне.

Состояние инфекции как всякого биологического процесса динамично, динамку взаимодействия обычно называют инфекционным процессом. С одной стороны инфекционный процесс включает: внедрение, размножение и распространение возбудителя в организме, а также патогенное действие, а с другой стороны реакцию организма на это действие.

Патогенное действие возбудителя может быть неодинаковым. Оно проявляется в форме инфекционной болезни различной тяжести, в другом без ярко выраженных клинических признаков в третьих проявляется лишь изменениями, выявленными вирусологическими, биохимическими, иммунологическими методами. Это зависит от:

- количества и качества возбудителя, проникшего в восприимчивый организм, условий внутренней и внешней среды, определяющих резистентность животного и характеризуются взаимодействием микро и макроорганизмов. По характеру взаимодействия возбудителя болезни и организма выделяют 3 формы:

1.инфекционная болезнь – это инфекционный процесс, характеризуется определенными клиническими признаками, а также нарушениями, функциональными расстройствами и морфологическими повреждениями тканей.

2.Микробоносительство – иммунологическая субинфекция. Дифференцированный подход к различным формам инфекции дает возможность правильно вести диагностику инфекции выявлять зараженных животных в неблагополучном стаде. Патогенез любой инфекционной болезни определяется специальным действием возбудителя и ответными реакциями организма, зависящими от условий, в которых происходит взаимодействие микро и макроорганизма. При этом немаловажное значение имеют пути проникновения и распределения возбудителя. Ворота возбудителя: кожа, слизистые, мочеполовая система, плацента.

Каждый вид возбудителя эволюционно приспособился к таким путям внедрения, которое обеспечивает благоприятные условия для размножения и распространения – входные ворота для каждой инфекции характеризуется специфичностью. Чтобы проводить профилактику необходимо учитывать специфичность ворот инфекции. Например, при ИНАН возбудитель проникает через кожу при укусе насекомых. При ящуре основной путь алиментарный, при бешенстве – через покус.

Классификация вирусных инфекций.

Различают автономные и интегрированные инфекции. Автономные - при этом вирусный геном реплицируется независимо от клеточного генома. Автономная инфекция характерна для большинства вирусов.

Интегрированные инфекции – вирусный геном включается в состав клеточного генома, т.е. интегрируются в клеточный геном и реплицируются вместе с ним. При этом вирусный геном реплицируется и функционирует как составная часть клеточного генома. Интегрировать может как полный геном так и часть. При интегрированных инфекциях нет ни сборки вирусных частиц ни выхода.

Автономная инфекция – клетка иногда приобретает способность к неограниченному делению в результате нарушения регулирующих механизмов, контролирующих деление. Это чаще наблюдается при онкогенных инфекциях.

Продуктивная и абортивная инфекции:

1.Продуктивная – завершается выходом инфекционного потомства.

2.Абортивная - инфекционного потомства не образуется или его мало.

Формы течения – как и продуктивная, так и абортивная могут протекать в острой и хронической форме. Острая инфекция – это инфекция, в результате которой клетка либо выздоравливает либо погибает. Острая инфекция на клеточном уровне может быть цитолитической (когда происходит гибель клетки).

Хроническая инфекция – это инфекция, при которой клетка продолжает продуцировать вирусные частицы в течение длительного времени и предает эту способность дочерним клеткам. Чаще хроническую форму приобретает абортивная инфекция т.к. вирусный материал накапливается и передается дочерней клетке.

Смешенная инфекция – клетка заражается двумя или несколькими разными вирусами, в результате чего в клетке могут совмещаться два и более инфекционных процесса. Возможно несколько вариантов взаимодействия вируса в процессе смешанной инфекции:

1.Интерференция – один вирус подавляет действие другого. 2.Комплементация (экзальтация) – один вирус усиляет действие другого.

Классификация вирусных инфекций на организменном уровне.

В основу классификации положено:

1.Генерализация вируса

2.Продолжительность инфекции

3.Проявление клинических симптомов

4.Выделение вирусов в окружающую среду

Одна из форм может переходить в другую (например, очаговая в генерализованную, острая в хроническую).

Очаговая инфекция.

Вирус действует вблизи входных ворот инфекции, в связи с локальной репродукцией. Они имеют более короткий скрытый период по сравнению с генерализованными.

Генерализованные инфекции.

После ограниченного периода репродукции в первичных очагах происходит генерализация инфекций – вирусы проникают в другие системы, например при ящуре, полиомиелите, оспе.

Острая инфекция.

Длится непродолжительный период и протекает с выделением в окружающую среду. Заканчивается гибелью или выздоровлением.

Персистентная инфекция.

При продолжительном взаимодействии вируса с организмом. Она может быть латентная, хроническая, медленная.

Латентная инфекция – не сопровождается выделением вируса в окружающую среду, при определенных условиях может переходить в острую и хроническую.

При гриппе, сепсисе, СПИДе и др.

Хроническая инфекция.

Это длительно текущий процесс. Характеризуется периодами ремиссии (аденовирус, герпес).

Медленные инфекции – своеобразное взаимодействие вируса с фагом и характеризуется длительными инкубационными периодами.

Источники инфекции.

При изучении любого инфекционного заболевания важно знать источник, место постоянного обитания и размножения, пути распространения, место и сроки сохранения, возникновения во внешней среде, способы передачи от больных к здоровым.

Естественная среда – живой организм, здесь он находит все условия существования. Длительность пребывания вирусов колеблется в значительных пределах и зависит от биологических свойств, реактивности организма. От условий патогенеза. Источники инфекции – только зараженные организмы. Они играют роль лишь в процессе передачи. Большинство животных выделяют вирусы с экскретами, секретами, кровью, истечениями, мокротой. При большинстве вирусных инфекций в основе патогенеза лежит вирусемия (ящур, чума и др). При этих заболеваниях вирус выделяется всеми возможными путями. При хроническом течении вирусовыделение менее интенсивно, но может быть длительным. При вирусных заболеваниях локализация ограничивается одним путем: пневмонии – с каплями мокроты. Самое интенсивное выделение вируса во внешнюю среду наблюдается в острый период заболевания, однако при ряде заболеваний и в инкубационный период. Бессимптомные инфекции протекают при вакцинировании живыми вакцинами.

Факторы противовир им-та,их хар-ка и роль.

3 котегории защ-х мех-в:

1)Естественная видовая резистентность- невосприимчивость,кот обусловлена врожденными биол-ми особ-ми, присущи-ми данному виду жив-го.Защ-ые мех-мы(первая линия обороны).Этот вид перед-ся по наследству(чел не воспр к чуме крс).Ест воспр-ть обусл-на отсутст-м условий для размнож вир:не происх адсорбции,проникнов и депротеиниз вир.

2)Неспециф факторы резистентности,вкл клет-ые и физиол-ие реакции(интерфероны,ингибиторы,фагоцитоз, темпер-й фактор)

3)Специфич-ие факторы иммунитета,проявл-ся при иммунизации или после переболевани

Неспецифические факторы.

-Температура

-Гормоны – снижают резистентность, однако соматотропные гормоны повышают резистентность и усиливают воспалительную реакцию.

-Беременное животное заболевает быстрее и заболевание протекает более тяжело.

-Физиологическое состояние выделительной системы – скорость выделения вируса из организма.

-Гуморальные факторы – наличие сывороточных ингибиторов (термостабильных или термолабильных). У каждого вида преобладает свой тип.

Интерферон,его образ-ие,роль и противовир д-ие.

При первичных вирусных инфекциях основную роль при выздоровлении играют кл. факторы иммунитета, одним из которых явл. интерферон. По своим хим. св-вам интерферон явл. белком, который сост. из группы низкомоле-кулярных белков. Интерферон подавляет размножение самых различных вирусов, не имеет видовую специфичность. Он не токсичен для клеток организма, не имеет сенселебирующего действия, что позволяет его многократно вводить в организм, для профилактики или терапии. Продуцировать интерферон в ответ на внедрения вируса обладают все кл. организма, но наиболее активно продуцируют лимфоциты и кл. селезенки. Интерферон не оказывает посредственное воздействие на вирус. Антивир д-ие ИФН не связано с синтезом какого-то нового белка,а проявл-ся в увел-ии акт-ти ряда ключевых ферментов клет-го обмена в-в(протеинкеназы и синтетазы)=>блок-ся стадии инициации и трансляции=>разр-ие вир-ой иРНК

Клет-ый противовир им-т и его знач-ие.

Фагоцитоз-уничтожение инфицир-х вирусом кл-к.

Макрофаги-кл-ки,кот обл-ют высокой фагоцитарной активностью Все макрофаги объед-ны в сист мононуклеар-ных фагоцитов(СМФ):кл-ки предшест-венники и промоноциты (костный мозг); моноциты(переферич кровь);макрофаги (соед тк-гистиоциты,печень-купфровы кл-ки,легкие-альвеол макрофаги,лимф узлы, селезенка, серозные полости,костн тк,нервная тк).Фагоцитоз не просто уничтожает чужеродный агент,но и представляет его для цепи иммунной реакции

. Противовирусный иммунитет. Антитела.

Наиболее специфическая реакция на вирусную инфекцию - это, конечно, выработка антител. Циркулирующие антитела, по-видимому, играют важную роль в предупреждении некоторых вирусных инфекций. Например, как после заболеваний, вызываемых многими вирусами, так и после вакцинации наблюдается длительный иммунитет и в сыворотке крови выявляются специфические антитела. Циркулирующие антитела при ряде вирусных инфекций, вероятно, служат барьером, препятствующим распространению вируса по всему организму. На это указывает тот факт, что при кори и свинке раннее введение глобулина блокирует дальнейшее развитие болезни. Вероятно, при естественно протекающих заболеваниях быстрое появление антител в крови может препятствовать распространению вируса из первичного очага инфекций. После инъекции кроликам вируса полиомиелита уже через 24 часа с помощью достаточно чувствительного метода в сыворотке можно обнаружить антитела к этому вирусу. Поэтому вполне возможно, что именно такие ранние антитела ответственны за тот факт, что у человека размножение этого вируса в глотке и кишечнике в большинстве случаев не ведет к его распространению по всему организму. Как полагают по той же причине немедленная вакцинация укушенного больным животным человека защищает его центральную нервную систему от поражения вирусом бешенства.

Инактивир противовир вакц,их получение ,св-ва,примен и отличие от живых.

-наработка вирус содержащего материала с использованием з-лых полевых шт-в.

-инактивация вируса-разр-ют геном,но не белки,те Аг-свойства (формалин, бета-пропиолактон, препараты азадинового ряда, температура, УФ, гамма-лучи, сульфат меди).

-Добавление адьюванта в инактивтро-ванную вакцину для увелич активности. Адьювант адсорбирует на своей поверх-ности частицы разрушенного вируса (сорбент-адьюванты: гидрат окиси Al,соламин,линолин или масляные).

-Добавление сапонинов для супер-раздражающего действия при в/м и п/к инъекциях. Применяют в очень малых концентрациях для образования воспале-ния в месте введения.

Недостатки(преим-ва-безвредны д жив-х)

-кратковрем созд им-та(до 6мес)

-необх повторить(через 2-3нед)в значитV

-малая транспортабельность

-исп-ть «на игле»-индивид применение

-более сложные по составу

Живые вир вакц,их св-ва,примен и отлич от инактивир.

Живые противовир.вакцины предст. собой лиофилизированные взвеси вакцин. штаммов вирусов, выращ. в разл. биосистемах (КЭ, КК, в лаб жив.)-получают ослабл-й штамм). Осн. Св-вом явл. стойкая утрата способ. вызывать в орг-ме привитого жив. типичное инф. Заболеева-ние, также обл. способностью «приживляться» в орг. жив., т.е размножатся. Пребывание и размножение вакцинного штамма продолжается обычно 5-10дн. до неск. недель и не сопр. клин. проявлениями, хар. для данной б., приводят к форм. иммунитета против инф. забл. Преимущества: 1)высокая напряженность и длительность создаваемого ими иммунитета, приближ. к постинфекц(1 год и более). 2)возможность для большинства однократного введения в малых дозах.3)Введение не только п/к, но и перорально и интерназально. Недостатки:1)чуств к неблагоприятным факторам. 2)Строгие рамки хранения и транспортировки – темпер – 4-8С. 3)Недопустимо наруш. вакуума в апулах с вакцинами. 4)нужно долгое время для их получения5)м возвращаться в патогенное состояние 6)Строгие соблюдения правил асептики(чтоб не занести кондаменанты, др вирусы).

ДНК-вакцины,их получ,св-ва,примен и отлич от цельновир-х.

Осн ДНК вакцины-бактериальные плазмиды,сповобные эффективно размн-ся в кл-ах E.Coli.Плазмиду получ генноинжен-м методом. Затем рекомбинантную плазмиду вводят E.Coli и выращ-ют на питат средах. Очищают, выделяют рекомбинантные плазмиды и вакцинируют жив-х.Плазмида проникает в кл-ку и в ядро=>транскрипция=>иРНК=> на рибосомы=>иммуногенные белки,кот разрезаются на отдельные пептиды. Пептиды+ГКГС=>транспорт на пов-ть кл-ки. Подходят Т-киллеры=>их активация=> могут убивать кл-ки,инфец этим вирусом.

Если захв-ся макрофагами=>то подходят Т-хелперы=>стимул-т Т-киллеры и В-лимфоциты

Преим-ва:

-действ 3-6 мес

-доза введ минимальная

Субъед вакцины,их получ,св-ва, примен и отличие от цельновирионных вакцин.

Преим-ва:

-безопасны,тк не сод-т вируса

-свободны от вредных примесей

-стабильны инее требуют хранения в рефрижератарах

3 метода получения:

1)получают большое кол-во вируса, очищают и выделяют иммуногенные субъединицы(«Сплит-вакцины»)-очень дорого.

2)Получение синтетич вакцин-синтез иммуногенных Аг: 4 белка вир ящура VP-1-4.Иммуногенный белок VP-1.К нему «пришивают» синтетич полимеры=> увелич-ся иммуногенность. Напр против ящура,гепатитаВ, инцефал-го клеща.

3)С использ-ем методов генной инженерии: сшивание нукл к-ты и бактериофага(микроба), и заставить его синтезировать белки(субъед или молекул-ую вакцину)

Принцип лаб.диагн вир.болезней

1. Индикация вируса в пат.мат. Путем: 1)обнаруж.вирионов методам: -электр. Микроскопии-все вир; -свет.микр. – только вир.оспы. 2)обнаруж.вир.Аг- в серолог.р-циях(РИФ, ИФА, РСК, РДП, РНГА), 3)обнаруж.телец-вкл. Методами: -свет.микроск.(тельца Бабеша-Негри при бешенстве), -люминисцент.микр. 4)обнаруж.вир.нуклеин.к-т методами: ПЦР, ДНК-зондов; 5)обнаруж. гемагглютининов-РГА; 6)обнаруж. инфекц. актив.вир. методом биопробы на живот, КЭ, КК.

2. II. Изоляция (выдел) вир из пат.мат.: биопроба на чувств.жив.сист. к предполаг.вир: 1)живот(лабили ест. воспр) Признаки размнож: а)клин.симпт; б)пат.изм; в)гибель 2)КЭ: а)гибель; б)пат изм; в)наличие РГА (д гемаглют.вир); 3)КК: а)ЦПД; б)РГАд; в)бляшки; г)РИФ

3. идентифик.выдел.вир:1)в серолог.р-циях: РН,РТГА,РТАГд,РИФ,ИФА,РСК, РДП,РНГА. 2)ПЦР IV. Док-во этиол. Роли выд.вируса: В серологич.р-циях: РН, РТГА, РТГАд, РИФ, ИФА, РСК, РДП, РНГА и др. В р-циях Аг-выделенный вирус, Ат- парные сыворотки. ↑титра АТ во 2сыв. в 4 и более раз свидетельствует о этиологической роли выдел.вир. V.ретроспектив.диагн.: исслед.парн.сыв. в серолог.р-циях:РН,РТГА,РТГАд,РИФ, ИФА,РСК,РДП, РНГА. Аг-стандарт.эталон. Аг; Ат-парные сыв. «+»-при↑титра Ат во 2-х пробах сыв. по сравн.с 1-ми в 4 и более раз.

Осн требов к раб с вируссод-ми мат-ми,чем они обусловл и как их вып-ть.

1.Не допускать рассеивания вируса в окружающую среду(не сливать в канализ-ию).

2.Не допускать контаменации (загряз-нения) вирус содержащего материала бактериями и грибами(раб-ть над пламенем горелки стерильн инстр и стерильной посудой).

3. Личная безопасность.

Для выполнения этих треб. необходимо собл. след. правила работы:

1)Наглухо застегнутый халат.

2)В лаб-ии не принимать пищу и воду. 3)Чистота и порядок на раб. месте, не должно при работе быть лишних предметов.

4)Работать сидя, не отвлекаясь. 5)Переливать жидкий вирус только над дизенфецир. жидкостью.

6)не брать пипеток в рот, пользоваться грушей.

7)Использ. предметы собирать в стерилизатор.

8)Запр. выносить ПМ за пределы ауд. 9)При разлитии исл. материала сообщить преподавателю для проведения дезинфекции.

10)После работы привести в порядок раб. место.

ПРАВИЛА РАБОТЫ В ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ. ТЕХНИКА БЕЗОПАСТНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ВИРУСОСОДЕРЖАЩИМ МАТЕРИАЛОМ».

Весь персонал лаборатории проходит инструктаж и обучение безопасным методам труда, обеспечивается спецодеждой, спецобувью, средствами санитарной защиты и защитными приспособлениями в соответствии с действующими нормами. Основные правила работы следующие: 1) вход в производственные помещения посторонних лиц, а также вход сотрудников в лабораторию без халата и сменной обуви категорически запрещен; 2) запрещено выходить за пределы лаборатории в халатах и спецобуви или надевать верхнюю одежду на халат, курить, есть и хранить в лаборатории продукты питания. В боксе работают в стерильном халате, маске, шапочке, при необходимости надевают резиновые перчатки и очки. Обязательно меняют обувь. 3) весь материал, поступающий в лабораторию на исследование, должен рассматриваться как инфицированный. С ним надо обращаться очень осторожно, при распаковке его банки следует обтирать снаружи дезинфицирующим раствором и ставить их на поднос или в кюветы. Рабочее место на столе покрывают несколькими слоями марли, увлажненной 5%-ным раствором хлорамина. При работе с пипетками пользуются резиновыми грушами. Пипетки, предметные и покровные стекла и другую посуду, бывшую в употреблении, обеззараживают, погружая в 5% хлорамин, фенол, лизол, серную кислоту. 4) по окончании работы рабочее место приводят в порядок и тщательно дезинфицируют. Вируссодержащий материал, необходимый для дальнейшей работы, ставят на хранение в холодильник и опечатывают. 5) руки тщательно промывают 5% хлорамином, перчатки снимают обеззараживают вторично, дезинфицируют и моют. При работе в вирусологической лаборатории сотрудники должны строго соблюдать методы и правила асептики и антисептики. Асептика – система мероприятий и приемов работы, предупреждающих попадание МО и вирусов из окружающей среды в организм человека, а также исследуемый материал. Она предусматривает использование стерильных инструментов и материалов, обработку рук сотрудников, соблюдение особых санитарно-гигиенических правил и приемов работы. Антисептика – комплекс мероприятий, направленных на уничтожение МО и вирусов, способных вызвать инфекционный процесс при попадании на поврежденные или интактные участки кожи и слизистых оболочек. В качестве антисептиков используют этиловый спирт (70%), спиртовой раствор йода, зеленка и другие. Дезинфекция – обеззараживание объектов окружающей среды путем уничтожения патогенных для человека и животных МО и вирусов физическими способами и с помощью химических веществ. Стерилизация – обеспложивание, полное уничтожение МО и вирусов в различных материалах. Ее проводят физическими и химическими методами.

Мет консерв вирусов и их практич значение.

IВоздействие физических факторов:

1)Д-ие температуры-хронить в холод-ке:

Т=4С до 1 месяца

Т=-10С до 1 года

Т=-25С до 2х лет

Т=-70 до 6 лет

Т=-196С(жидкий азот) до 10-12 лет

2)Лиофильная сушка- высушивание вир из замороженного сост под вакуумом. Одновременно расфасовывают в ампулы(для вакцин).Ампулы хранят в холодильнике Т=+4С до 10-12 лет

II Воздействие хим-х факторов:

50% глицерин, его готовят на физ р-ре. В нем пересылают пат мат из хоз-ва в лаб-ию. Вир хранится в теч 2х недель

Мет-ды освоб-ия от вир предм и мат-в.

IВоздействие физических факторов:

1)Д-ие температуры: Т=100С-гибнет за неск-ко секунд(кипячение)-кипятят мет-ие инстр-ты;в стерилиз-ах 15-20 мин

Фламбирование-прожигание над пламенем горелки

Сухой жар: сухожарный шкаф Т=160-180С(прокаливают посуду)

Автоклавирование:для стерилиз посуды, халатов,растворов Т=200С(текучий пар,давл 2атм)

УФ лампы(БУВ-15;30)-1час в боксе

УЗ-неск-ко секунд

II Воздействие хим-х факторов:

1)Исп-ие разл-х щелочей в качестве дез р-ра: NaOH, KOH (3-5%) для пипеток после вируса-неск-ко часов.

2)Карболовая к-та,лизол,молочная к-та, перекись водорода(Н₂О₂)

Экспресс-методы диагностики.

1)обнаруж.вирионов и телец-вкл.: а)свет. микр.(вирусоскопия)-только вир.оспы(26-360нм). Матер.визикула. б)электр.микр. Тельца-вкл-образ, появл.внутри к-к, в рез-те размнож.в них вир –спец.окр. 2)обнаруж вир.АГ: РДП(малая чувств., т.е. в мат.д.б. много белка→надо концентрир. РИФ-свеч. в люминисцент.микр ИФА- АТ-ферментным комплексом дает цветную р-цию. .РСК -. Задержка гемолиза – р-ция «+». Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-сист. – р-ция «-«. РНГА.

Обнаруж.вир.нуклен.к-т: ПЦР, ДНК-зонды

Обнаруж.гемаглютининов - РГА

Биопроба – экспериментальное заражение материалом от больных жив. лаб. или естественно восприимчивых жив

Методы культивир-ия вир в лаб-ях и на биофабриках.

Лаб жив:бел мыши и крысы,кролики, хомячки,мор свинки.

Требования:1)получ из питомников, благопр по инф заб-м;2)соотв-ть по виду и возр-ту опред-мы вир;3)их сод-т в спец помещ-вивариях;4)при зараж жив-х метят

КЭ:нельзя пол-ть специф картину забол-я.

Получ-т из благопол-х птицеф-к от здорового пог-я.Скорлупа дБ чистая,ср размеров,однозарод,бел цвета.

КК-кл-ки многокл орг-в,жив-ие и размн-ся вне орг-ма.

3 вида:

1)Первично трипсинизированные культ-ы- полученные непоср-но из орг-ма.(почка, печень,легкие)-монослой(растет в 1слой), те Кл-ки др на др не наползают

2)Диплоидные к-ры-получ из первичных. М пройти 50+-10 пассажей;диплоидный набор хромосом.

3)Перевиваемые к-ры-были пол-ны из первичных.Их можно перевив из флакона во флакон;неогран-ое кол-во пассажей.Имеет гетероплоидный набор хромосом.Некот м обладать онкогенной активностью-опухоли.

СОЦ-сердце обезьяны цикомольгус

Vero-почка зел мартышки

ПЭК-почка эмбр коровы

ЛЭК-легкие эмбр коровы

Таурус1-почка быка.

Мет обнар вир в пат мат.

Индикация вируса в патологическом материале.

1. Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae), электронная микроскопия.

2. Обнаружение телец-включений. (тельца Бабеше-Негри при бешенстве)

3. Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции.

4. Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция).

5. Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток).

6. Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов (в настоящее время практически не используется по причине наличия более точных методов).

Что такое титр вир и принцип его опред-ия по инфекц-му д-ию вир.

Титр – это кол-во вируса, содер в ед объема материала.Вир м титровать по инфекц-му д-ию.

Титр по эф-ти их д-ия,те какой эф-т вир оказ-ет на ту или иную жив сист..Эф-ть д-ия вир выр-ся в эффект-х дозах(ЭД). За 1ЭД₅₀ прин-ем такую дозу вир,кот при введ гр живых сист.выз-ет эф-т в 50% случаев(не мене 4 жив систем). Инфекц Титр вируса-кол-во эффект-х доз его в ед V(чаще в 1мл) 1ЭД м обозн-ся по-разному,в зав-ти от эффекта и от той живой сист,на кот мы титруем вирус: 1)Гибель: ЛД₅₀ (летальная доза)-лаб жив, ЭЛД₅₀(эмбр лет доза)-кур эмбр, кк-нет гиб 2)Видимые изменения(клиника,пат изм):

ИД₅₀(инфекц доза)-лаб жив,ЭИД₅₀ (эмбр инф доза) и ООЕ(оспообр-ие вир ед-вир оспы голубей)-кур эмбрионы,ЦПД₅₀ (цитопат доза) и БОЕ(бляшкообраз-ие ед- под ТВ питат средой)-кк.

Берем неск-ко пробирок(напр 5),размор-ем вирус.В кажд проб-ку по 9мл физ р-ра. Затем в 1 проб из бутыли с вир переносим 1мл вир(пипетку в физ р-р),размешать. Затем из сод-го 1й во 2 1мл смеси,из 2й в 3ю и тд…из последний не выливаем.

Каждым развед-ем мы зар-ем четное число биол систем(не менее 4х)-4 кур эмбриона.Ставим в термостат,затем учитываем.

Положит-й эф-т(+)-гибель

1(1:10)++++

2(1:100)++++

3(1:1000)++--

4(1:10000)----

5(1:100000)----

В развед 1:1000-50% эф-т =>в этом развед сод-ся 1ЭД₅₀ =1 ЭЛД₅₀

Титр вир=числу(во сколько раз надо развести исх-й вир,чтобы пол-сь 1ЭД₅₀)

Тв=1000 ЭЛД_50/0,2=5*10³ ЭЛД_50/мл

0,2-кол-во мл,каким зар эмбрион.

Если эф-т не виден,то подсчёт инфекц титра проводят по методу Кербера или методу Рида и Менча.

Формула Кербера: lgЛД50=lgD+lgd/2-lg∑r/n

D-наибольшее развед вир,кот дает еще 100% эф-т d-коэф-т разведения(=10);r-кол-во (+)-павших;n-кол-во живых систем,зар-х каждым разведением(со 2-го развед,тк в 1-м они и так погибнут).

Что такое титр вир и принцип его опред по гемаглютинир-му д-ию.(Тга)

Титр – это кол-во вируса, содер в ед объема материала.Вир имеют белок- гемагглютинин.Они склеивают эр. Титр опред-ют по эф-ту гемагглютинации.Выр-ся ГАЕ(гемагл ед). 1ГАЕ-наибольшее развед вир,кот еще выз-ет агглют-ию эр на «++»

РГА Мб качественной(для индикации (обнаруж)вируса-капельная РГА) и колич-й(Тга).

Р-ция пров-ся в плестеглазовых (пласти-ковых) планшетах.Не треб-ся стирильн условий

1)Готовят последов-ое 2х кратное развед вир(1:2,1:4,1:8…)

2)В каждое развед доб-ют равный V 1% взвеси эритр-в опред-го вида и оставл-ют на контакт

3)Уч-т рез-т РГА в крестах:

ГА(100-75%эр)-«+++» - полный зонтик

ГА(50%эр)-«++» - неполн зонтик (пол эр обр-ют взвсь,а др пол осела на дно)

ГА(25%)-«+»- маленький зонтик

ГА-«-»-пуговка(все эр оседают)

4)Опред-ют гемаглют-й титр(Тга):снач узнают в каком развед нах-ся 1ГАЕ.

Тга-то число,во сколько раз был разведен вирус,чтоб в получ-м развед сод-сь 1ГАЕ

Берем 6 пробирок,6-контроль(эр+физ р-р): 1)(1:2)0,2мл физ р-ра(разбавитель)+0,2мл вир БН+0,2мл 1%взвеси эр-в петуха;2)(1:4)0,2мл из пред-й проб-ки+0,2физ р-ра+0,2 1%взвеси и тд до 5-й.Оставляем на контакт на 30 мин при комн-й темпер-ре.

От чего зав-т р-ия ГА:

1)от наличия вир гемагглютинирующего

2)исп-ся эр опред-го вида хозяина(ВБН-эр кур и петухов);

3)опред усл для постан р-ции:буф-й р-р (физ р-р,карбонатный,фосфатный буфер); рН(нейтр),комн темп,время конт(30мин)

Учет нач-ем с того мом-та как сраб контроль:

6)контроль-все эр осели «-»

5)пуговка «-»

4)неполный зонтик «++»(1ГАЕ) =>эф 50%

3,1 и 2)полн зонтик «+++»=>2,4 и 8 ГАЕ

=> Тга=16ГАЕ-во сколько раз разведение(в 16 раз в 4 лунке)

Использование куриных эмбрионов в вирусологии.

Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день.

Топография куриного эмбриона (продольный разрез, 12 дней)

1. Скорлупа

2. Подскорлупная оболочка

3. Воздушная камера

4. Аллантоисная полость

5. Желточный мешок

6. Альбуминный мешок

7. ХАО – хорион-аллантоисная оболочка

8. Амниотическая полость

9. Эмбрион

10. Канатик (соединение желточного мешка с пуповиной)

Для заражения выбирают здоровые эмбрионы. Для этого проводят овоскопию. На скорлупе делают пометки карандашом – границы воздушной камеры и местоположение зародыша.