Научно обоснованные пути скрининга новорожденных для выявления мышечной дистрофии Дюшенна

erry R. Mendell MD1,*, Chris Shilling MS1, Nancy D. Leslie MD2, Kevin M. Flanigan MD1, Roula al-Dahhak MD1, Julie Gastier-Foster PhD1,3, Kelley Kneile BS3, Diane M. Dunn BS4, Brett Duval BS4, Alexander Aoyagi BS4, Cindy Hamil AS4, Maha Mahmoud BS4, Kandice Roush RN1, Lauren Bird RN1, Chelsea Rankin BS1, Heather Lilly BS5, Natalie Street MS, CGC6, Ram Chandrasekar PhD5, Robert B. Weiss PhD4,*

Материалы и методы

Изучаемая популяция.

Это исследование включало 4 фазы. Фаза 1 : усилия были направлены на создание групп населения на основе диапазона КК в качестве критерия, установления порога, при котором необходимо проводить анализ мутаций гена дистрофина. Эти исследования были проведены в Департаменте здравоохранения Огайо (ODH) с помощью анонимного анализа сухой капли крови у новорожденных мальчиков и девочек. В фазе 2 данного исследования, родители новорожденных мальчиков были приглашены для участия в пилотном исследовании проводимом в 4 крупных больницах в Колумбусе и Цинциннати, штат Огайо, с марта 2007 по сентябрь 2008 года. Новорожденные мальчики, кто родился в любой из участвующих больниц имеют право на исследование. В фазе 3, программа была расширена за счет включения в общей сложности 43 больниц в штате Огайо, начиная с октября 2008 года и вплоть до сентября 2010 года. В фазе 4, заключительный этап исследования, пятна крови у новорожденных, мужчины и женщины снова прошли анонимное обследование ODH (июнь 2010-январь 2011). Цель на заключительном этапе - увеличение числа образцов мужчин и включение женщин. Мы включили оба пола не с расчетом на выявление носителей Х-сцепленных заболеваний таких, как МДД, но с конкретной целью укрепления наших возможностей выявления мутаций гена при проверке на 2ом уровне скрининга (КК из сухого пятна крови затем анализ ДНК) для решения вопроса о повышенном уровне КФК у субъектов, у которых не обнаружены мутации гена МДД. Учитывая то, что ложно-положительных повышение КК является потенциальной проблемой, мы хотели постараться определить мутации характерные для других форм мышечной дистрофии.

Дизайн исследования

Обследование населения на уровень КК методом сухой капли крови

В фазе 1 исследования диапазон КК населения был построен по данным тестирования 30 547 последовательных анонимных образцов сухой капли крови (табл. 1, рис 1). Поставлен вопрос о изменчивости, связанной с полом, весом и возрастом новорожденных на момент взятия пробы. Данное исследование имеет важное значение в создании будущих руководящих принципов для определения уровня КК, потому что мы не обнаружили существенных различий в средних значениях между мужчинами (251,52 ± 113.85U / л) и женщинами (246,39 ± 113.86U / л), с минимальным эффектом, связанным с весом при рождении. Другой интересный момент, что, хотя наша целевая группа фокусируется на исследовании сухой капли крови, собранной в течение первых 48 часов, результаты данного исследования были увеличены, потому что деятельность КК уменьшается с течением времени. Собранная нами информация показала, что КК не проявляют большого эффекта до 5 дней (> 120 часов). С этой базой данных мы смогли разработать наш протокол для 2-х уровневого плана испытаний. Первоначально, мы решили начать анализ ДНК гена МДД на уровне КФК в ≥ 600U / л- 3 стандартных отклонения от среднего значения (0,75% экранированных населения, см. таблицу 1, рис.1

Реализация тестирования кк у новорожденных

2 и 3 фазы являются добровольными и требуют письменного согласия одного из родителей или опекуна на основе утвержденных протоколов Экспертного совета (IRB) каждой участвующей больнице. В течение 48 часов после рождения, обученные сотрудники подходили к родителям новорожденных мальчиков и рассказывали об участии в исследовании. Была представлена ​​брошюра с описанием преимуществ и рисков. Карты с каплями крови поставляются в ODH и включают в себя демографические данные, дату и время сбора, а также пять 100 мкл образцов крови, полученных из пятки в отдельных кругах на листе фильтровальной бумаги, прикрепленном к верхней части коллекции карт. Два круга используются для тестов входящих в обязательный скрининг новорожденных, а 2 из 3 оставшихся кругов были использованы в рамках настоящего исследования.

Все результаты отправлены по почте лечащему врачу или непосредственно в семью, если так просили родители во время оформления согласия. В случае положительного результата и выявления МДД мутации, семье сообщалось по телефону, и назначалась консультация с лечащим врачом и специалистом по нервно-мышечным заболеваниям из нашей команды. Для результатов КK из сухой капли крови выше порогового значения при отрицательном тестировании ДНК на мутациями гена дистрофина, лечащий врач был уведомлен по телефону, и предлагалось повторить тестирование венозной крови на КК. В случаях, когда снова определялся высокий КК при повторном тестировании, наши сотрудники предлагали записаться на прием в ближайшую клинику Ассоциации Мышечной дистрофии для дальнейшего обследования.

Материалы.

Тест на КК

КK тестирование проводилось на сухой капли крови, полученные для всех 4 фаз, выполнялось в лаборатории ODH с использованием ранее опубликованных методов. Сухие пятна крови с помощью Wallac DBS (Perkin Elmer, Бостон, MA) помещают в лунки пластины с добавлением диаденозина пентафосфата (USB Corporation, Кливленд, Огайо). После инкубации при комнатной температуре для подавления активности фермента красных кровяных клеток, супернатант удаляли с помощью N-ацетил-L-цистеин для возобновления деятельности КK (Набор реагентов; Thermo Electron Corporation, Waltham, MA). КK ферментативная активность катализировалась трансфосфорилированием аденозин дифосфата (АДФ) и аденозинтрифосфата (АТФ).Ряд связанных реакций восстановленной формы никотинамид аденин динуклеотида (НАД) со скоростью, прямо пропорциональной деятельности КК, измеренной при длине волны 355 нм и длине волны излучения 460nm по флуорометр (Виктор 2D с Stacker, Perkin Elmer) . Для каждого образца, 5 измерений были проведены в течение 5 секунд (кинетический метод), а разница между первым и последним чтением каждого образца была использована для нормализации различий. КФК (в единицах на литр) была рассчитана для каждого образца по формуле независимо для каждой пластины с использованием внутреннего контроля, с заданными концентрациями КK , который загружался на каждую пластину.