(Материал подготовлен совместно с д в н, профессором Алтайского гау Барышниковым п.И.)

Цель занятия: ознакомится с различными вариантами ИФА, применяемимы в вирусологической практике.

Краткие теоретические сведения.

Иммуноферментный анализ (ИФА) (синонимы: иммуноэнзимный метод, реакция энзим-меченых антител, ELISA-тест) – группа методов, позволяющих выявлять комплекс антиген-антитело с помощью субстрата, который расцепляется ферментом с появлением окрашивания.

Иммуноферментный анализ – направление иммунохимии, разрабатывающее способы определения различных физиологически активных веществ с использованием ферментов в качестве маркеров антигенов и антител. Сочетание высокой специфичности антител и каталитической активности ферментов позволило создать универсальный метод для определения широкого класса соединений в диапазоне концентраций 10^–1 до 10^–12 г/мл.

Впервые этот метод был разработан в 1966 году Nacaue R., Pierce, а также Avraineos S., Uriel I. для обнаружения внутри клеток различных антигенов и антител. До 1971 года ИФА использовали преимущественно в гистологических исследованиях для определения мест локализации антигенов в срезах тканей различных органов.

В начале 70-х годов основное внимание исследователей было направлено на разработку методов ИФА для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. Современные методы количественного анализа подразделяются на две группы, принципиально отличающиеся способом отделения связавшегося с антителами (антигеном) ферментного конъюгата от свободного.

В основе первой группы методов, объединенных под названием «гомогенный ИФА», лежит процесс ингибирования ферментативной активности конъюгата при взаимодействии с растворимыми антителами. Анализ в этом случае происходит без участия твердой фазы. Однако методы гомогенного ИФА используются, как правило, только для определения низкомолекулярных антигенов: стероидных гормонов, токсинов, гаптенов и лекарственных препаратов в биологических жидкостях.

В основе второй группы методов, получивших название «твердофазный ИФА» или «гетерогенный ИФА», лежит разделение компонентов реакции с использованием антител (антигенов), иммобилизованных на нерастворимом носителе.

Методы этой группы в настоящее время получили наибольшее практическое применение в серологической диагностике инфекционных болезней благодаря своей чувствительности, специфичности, быстроте постановки и автоматизации учета.

В иммунологическом аспекте ИФА идентичен РИА, и все рассуждения о специфичности образования иммунных комплексов, влиянии гетерогенности препаратов антител и валентности антигенов на специфичность и эффективность РИА в равной степени справедливы и для ИФА

В основе метода лежит присоединение растворимых антигенов или антител к твердой фазе с сохранением иммунологической активности и применение фермента в качестве маркера иммунологической реакции, происходящей на твердой фазе. Фермент в данном случае служит маркером иммунной реакции и позволяет наблюдать ее визуально или инструментально. Иммобилизацию можно провести путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, которые разработаны для получения иммобилизированных препаратов ферментов. Но наиболее широкое распространение получил метод физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров, предложенный шведскими учеными. Белок в этом случае связан с поверхностью носителя менее прочно, чем при ковалентной иммобилизации, но простота разделения иммунных комплексов и не связавшихся антител (антигенов) обеспечила быстрое распространение этой модификации ИФА.

В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест (энзимсвязанный иммуносорбентный метод) или твердофазный метод ИФА.

Следует отметить, что все варианты количественных иммуноанализов с использованием меченых антител обладают следующими преимуществами по сравнению с другими вариантами:

антиген не подвергается метке и, следовательно, нет опасности его повреждения или изменения физико-химических свойств;

молекулы антител более стабильны и лучше антигенов сохраняют свою активность при мечении;

имеется возможность определения антигенов, которые с трудом поддаются метке или которые трудно получить в чистом виде;

в результате использования избытка меченых антител потенциально может наблюдаться более высокая чувствительность и специфичность, так как из гетерогенной популяции антител в первую очередь будут реагировать молекулы, обладающие высоким сродством к антигену (Орлов А., 1981).

Основными направлениями применения ИФА являются:

ранняя диагностика инфекционных болезней;

проведение массовых эпизоотологических обследований в целях своевременной профилактики животных от ряда инфекционных заболеваний, наносящих значительный ущерб животноводству;

определение иммунологического статуса у животных и изучение эффективности применения вакцин;

контроль качества биопрепаратов и соблюдение норм на предприятиях биологической промышленности.