Типы и техника постановки риа

В классическом варианте РИА используется конкурентный тип постановки реакции. В конкурентную среду вводят известное количество меченого антигена, который конкурирует с определяемым антигеном за места связывания специфических антител (Yalow R. et al.,1960).

Основные недостатки конкурентных методов заключаются в том, что для каждого определяемого антигена необходимо разрабатывать методы маркировки и способы получения антигенов высокой степени очистки. В том случае если антиген трудно выделить в чистом виде или провести его метку, наиболее подходящими способами его обнаружения являются варианты с использованием меченых антител.

Среди последних наибольшее распространение получил «сандвич» – метод.

Исходя из результатов собственных исследований «сандвич» – вариант РИА ставили по следующей схеме:

полистироловые пластины сенсибилизировали иммуноглобулинами в концентрации 20-25 мкг/мл в дистиллированной воде в течение 16-18 часов при 20-22°С;

остаточные сорбционно-активные центры на полистироле пластин блокировали 1% раствором БСА в 0,02М ФБР рН 7,2 в течение 60 минут при 37°С;

исследуемые пробы антигенов наслаивали в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20 и выдержали 60 мин. при 37°С;

специфический конъюгат наслаивали в ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20 в рабочем разведении 200 тыс. имп/мин и выдержали 60 минут при 37°С.

Все компоненты реакции использовали в объеме 0,1 мл. После каждого этапа (наслоения) пластину 3-х кратно отмывали физиологическим раствором рН 7,4 с 0,05 % твина 20.

При постановке реакции использовали контроли:

контроль конъюгата: в первый ряд лунок сенсибилизированной пластины вместо антигена вносят физиологический раствор рН 7,4 с 0,05% твина 20. Контроль конъюгата выявляет неспецифическое связывание меченых иммуноглобулинов с сенсибилизированной пластиной;

положительный контроль: в 2 лунки 2-го ряда сенсибилизированной пластины вносят стандартный специфический антиген;

отрицательный контроль: в 2 лунки 2-го ряда сенсибилизированной пластины вместо антигена вносят питательный бульон.

В качестве другого варианта РИА, особенно ценного в тех случаях, когда исследователь располагает лишь небольшим количеством антител, предложена непрямая методика, при которой используют антивидовые меченые антитела, направленные к иммуноглобулинам применяемой антисыворотки (Hales C. et al.,1975).

Учет и оценка результатов риа

Важной стадией разработки РИА является учет и оценка результатов.

Данный метод, как и ИФА, предполагает автоматический инструментальный учет, что исключает субъективность оценки и снижает практически до нуля возможность ошибочного толкования полученных результатов. Инструментальный учет результатов проводят просчетом лунок в колодце гамма-счетчика «Гамма-1». Исследуемая проба считается положительной при превышении счета связанной радиоактивности опытных образцов со специфическим антигеном над контролями в 2,5 и более раз.

Для визуального учета результатов РИА может быть использована авторадиография на рентгеновской пленке. Сущность этого процесса заключается в том, что на последнем этапе постановке реакции, после отмывания меченого препарата, под пластинку подкладывается свинцовый коллиматор с отверстиями и лист рентгеновской пленки любой марки. Смонтированная система тщательно изолируется от света и оставляется на экспозицию в течение 24-48 часов. Проявление пленки осуществляется согласно наставлению по ее применению, и сравниваются пятна затемнения от радиоактивного излучения положительных проб и контролей. Проба считается положительной при наличии интенсивно черной окраски.

Для диагностики инфекционных болезней РИА не получил такого распространения, как ИФА. Причинами этого являются недостатки, очевидные еще на заре разработки всех многочисленных модификаций метода:

1. короткий срок «жизни» антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами, ограниченный периодом полураспада изотопа;

2. высокая стоимость разового определения, обусловленная стоимостью регистрирующей аппаратуры;¹

3. отсутствие полевых вариантов регистрирующей аппаратуры, что делает невозможным использование РИА в лабораториях, ведущих широкие серологические обследования;

4. усиленные меры по технике безопасности, связанные с радиационным риском для персонала;²

5. риск загрязнения окружающей среды радиоактивными продуктами (Покровский В. и др.,1983).

Занятие 22. Иммуноферментный анализ (ИФА) .