1.4. Двигательная активность обонятельных жгутиков

Из вышеизложенного следует, что мембранные рецепторы и, по-видимому, вторичные посредники обонятельной трансдукции сосредоточены в жгутиках рецепторных клеток. Эти жгутики пребывают в непрерывном движении.

Их наблюдениями активно занимался А.А. Бронштейн с коллегами (1966, 1973, 1977). Посредством фазово-контрастной прижизненной микроскопии обонятельной выстилки различных животных вопреки отрицательным утверждениям некоторых исследователей (Lidow, Menco, 1984; Menco, Farbman, 1984), им удалось показать, что обонятельные жгутики всех позвоночных без воздействия на них раздражителей подвижны. Спонтанные перемещения этих нитеобразных образований в пространстве совершенно отличаются от ресничек мерцательного эпителия. Они совершают неупорядоченные асинхронные, изгибательные, волнообразные и воронкообразные движения. Короткие тонкие и толстые обонятельные жгутики колеблются с разной частотой: от 20 до 40 – 50 колебаний в минуту – первые и от 15 до 30 движений – вторые, а длинные двигаются с частотой 10 – 25 в минуту (Firestein et al., 1990; Frins, Lindemann, 1991).

Наблюдения за жгутиковыми перемещениями обнаружили интересный факт, касающийся их дистального участка. Судя по результатам электронно-микроскопического анализа, длинные обонятельные жгутики лягушек и крыс имеют структуру цитоскелета, образованную 9 х 2 + 2 микротрубочками в проксимальном отделе, но их дистальный участок имеет неполный их состав, и их число постепенно уменьшается до 1 - 2 (Бронштейн, 1977; Menco, Farbman, 1984; Matsuzaki et al., 1999). Таким образом, вершина жгутика оказывается лишенной тубулярного цитоскелета, а, следовательно, и молекулярных механизмов подвижности. Поэтому в активном локомоторном акте у них могут участвовать, вероятно, только проксимальный отдел, тогда как дистальная часть двигается пассивно вслед за ним, и в процессе движения обонятельного жгутика она может закручиваться в виде петли или диска (Бронштейн, 1977).

Значение подвижности жгутикового аппарата до сих пор неясно. Полагали, что основное ее предназначение сводится к перемешиванию обонятельной слизи с растворенными в ней молекулами пахучих веществ, что обеспечивает более быстрый их контакт с мембранными рецепторами. Однако это маловероятно, поскольку перемешивание слизевого секрета в носовой полости наземных позвоночных обеспечивается мерцательным эпителием (Бронштейн, 1977).

В настоящее время факт участия жгутиков в рецепторном процессе установлен. Важно теперь ответить на вопрос о том, какую роль в нем играет двигательная активность. Известно, что частота и направление движений ресничек обонятельных клеток изменяются в связи с различной степенью поляризации их мембраны, и что характер их движений контролируется посредством мембранного потенциала. В то же время имеются данные о возможности изменения трансмембранного потенциала в результате пассивного движения жгутиков (Бронштейн, 1977). Было высказано предположение, что изменения их локомоторной активности под влиянием одорантов могут приводить к изменению этого потенциала и что двигательная реакция обонятельных жгутиков может включаться в акт рецепции в качестве одного из звеньев этого процесса (Бронштейн, 1977).

Предположение А.А.Бронштейна, сформулированное около 30 лет назад, сохранило свою актуальность и нуждается в экспериментальной проверке. Можно думать, что изменения разности потенциалов на плазмолемме обонятельных жгутиков связаны с участием так называемые TRP-каналов (transition receptor potential channel). Впервые их описали в процессе фототрансдукции у D. melanogaster (Denis, Cyert, 2002). Затем гомологи были обнаружны и идентифицированы у червей, омаров, млекопитающих. Они вовлекаются в такие сенсорные функции, как боль, определение осмомолярности, слух и обоняние (Denis, Cyert, 2002). Мутация гена, кодирующего белок для этих каналов, локализованных в волосковых клетках, приводят к глухоте у насекомых и человека (Goodman, Schwarz, 2003).

TRP-каналы принадлежат семейству каналов механотрансдукции. Они активируются при действии внешних механических сил и сил, производимых собственными движениями, и преобразуют механическую энергию в мембранный потенциал. Полипептидная цепь этих каналов состоит из 1275 амнокислотных остатков, включает 6 трансмембранных сегментов (S1 – S6) и соответствует одному гомологичному домену альфа-субъединицы Са²⁺-канала L-типа (Mori et al., 1996; Hille, 2001). TRP-каналы представляют собой полифункциональные катион-селективные каналы, не чувствительные к мембранному потенциалу и содержащие канальный и энзиматический домены (Goodman, Schwarz, 2003). Показано, что они содержат три анкирин-подобных участка, которые соединяют интегральные мембранные белки с цитоскелетом (Hardie, Minke, 1993; Zhu, Birnbaumer, 1998; Putney, McKay, 1999). Протеины для всех этих каналов кодируются большим семейством генов. В настоящее время клонировано 7 генов млекопитающих, гомологичных trp (Zhu et al., 1996; Puney, McKay, 1999).

Показано, что один и тот же TRP-канал может вносить вклад как в механо-, так и в хемотрансдукцию и открываться химическими лигандами и механической силой. У C. elegance, например, он локализуется в жгутиках обонятельных клеток (AWA-клетки) и в полимодальных механочувствительных нейронах (ASH-клетки) (Goodman, Schwarz, 2003).

Накопились доказательства регуляции этих каналов липидными вторичными мессенджерами (IP₃, PIP₂, диацилглицеролом, арахидоновой кислотой). TRP-каналы относятся к каналам входа Са²⁺ из внеклеточной среды, не зависящего от внутриклеточных депо (Hardie, 2003). Некоторые типы этих каналов активируются вторичными посредниками, синтезирующимися в результате активации фосфолипазы С посредством рецепторных тирозинкиназ, а также истощением PI4,5,P₂, которое является следствием его гидролиза фосфолипазой С (Huang, Reishardt, 2003).

Чтобы выяснить участие двигательной активности обонятельных жгутиков в акте рецепции, необходимо было получить данные прямого визуального анализа их локомоции при действии физиологических концентраций одорантов. Такие попытки были (Бронштейн, 1977), но тогда не удалось выявить изменений движений под действием одорантов. Было показано, что остановка цилиарной подвижности не влияет на характер электрического ответа обонятельной выстилки (Минор, 1973), и это было подтверждено в исследованиях одиночных клеток (Dionne,1992).

По мнению А.А. Бронштейна (1977), цилиараный аппарат обонятельных клеток является специализированной антенной, обеспечивающей активный поиск и обнаружение одорантов в слизи.

Некоторые аналогии можно провести между поведением обонятельных жгутиков и таких одноклеточных организмов, как амебы, дрожжи и лейкоциты млекопитающих. Известно, что все живые клетки, как и обонятельные, могут воспринимать изменения химического состава своего окружения. Предложен термин “directional sensing” (“направленное чувство”), который относится к способности клетки определять направление и близость внеклеточного стимула (Parent, Devreotes, 1999). “Направленное чувство” необходимо для детекции аттрактантов, которые управляют, например, клеточной миграцией при хемотаксисе, а также, вероятно, при восприятии запахов ольфакторными рецепторными клетками.

«Направленное чувство» сопровождается тем, что клетка последовательно измеряет концентрацию аттрактанта в двух точках среды, и в зависимости от концентрационного градиента образует случайные пилотные филоподии или псевдоподии. Важно отметить, что при этом клетка не совершает направленного движения, и в ней не происходит реорганизации цитоскелета (Parent, Devreates, 1999).

Такое хаотическое рыскание очень похоже на спонтанные движения обонятельных жгутиков в отсутствии одорантов. Возможно, такой характер их двигательной активности обеспечивает рецепторной клетке “directional sensing” без пахучего стимула в среде, поэтому дистальный участок жгутиков, в котором сосредоточены механизмы взаимодействия с одорантом, лишен цитоскелета.

Однако в градиенте концентрации аттрактанта у амеб, дрожжей и лейкоцитов взаимодействие с хемоаттрактантом сопровождается реорганизацией их цитоскелета (Parent, Devreotes, 1999). Показано, что регуляция динамики цитоскелета и клеточной подвижности на всех уровнях организации живых организмов принадлежит р21-активируемым киназам - PAK1-3. Они являются серин-треониновыми киназами. Полагают, что их роль заключается в координации динамики актинового цитоскелета и микротрубочек при направленной локомоции клеток, а также других функций, требующих поляризации цитоскелета.

Активация РАК осуществляется по пути, зависимому от GTPаз или тирозинкиназ. Активированные РАК способны модулировать актиновый или миозиновый цитоскелет и играть основную физиологическую роль в контроле организации и регуляции цитоскелета. При этом они рекрутируются к ведущей стороне клетки. Активация клеточной подвижности под действием РАК связана, в частности, с увеличением фосфорилирования регуляторной легкой цепи миозина II. Следовательно, РАК способны модулировать клеточную морфологию, актин/микротубулиновую динамику и клеточную подвижность.

В процессах, требующих быстрой реорганизации актина ведущая роль принадлежит другому ферменту - LIM-киназе1-2, принадлежащей семейству сериновых киназ. LIM-киназа, в свою очередь, активируется РАК (Bokoch, 2003).

На примере амебы и лейкоцитов человека показано, что взаимодействие хемоаттрактанта с мембранным рецептором запускает цепь внутриклеточных реакций с участием посредников, которые вызывают перестройку цитоскелета в локальной области клетки, обеспечивающей в дальнейшем направленное ее движение (Parent, Devreates, 1999).

Возможно, подобная реорганизация цитоскелета может происходить и в обонятельных клетках в присутствии одорантов. Подтверждением такого предположения служат данные о появлении активных движений дистальных отделов жгутиков при изменении ионного состава или рН среды, а также наличие в них миозиноподобных белков (Бронштейн, 1966, 1977).

Важно подчеркнуть, что проблема инициируемой одорантами реорганизации цитоскелета в жгутиках не только не решается, но и не ставится при исследовании обонятельной рецепции.