3.1.6. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции аммиака

Во вторую группу исследуемых нами одорантов входили аммиак, обладающий острым запахом, и сероводород, имеющий гнилостный запах.

Источником аммиака служил нашатырный спирт, представляющий собой его 10% водный раствор (NH₃·6Н₂О). Обдувание обонятельной выстилки аммиаком (n=38) повышало интенсивность флуоресценции в среднем на 88 отн.ед. от исходного уровня. Амплитуда довольно быстро достигала своего максимума, и сигнал возвращался к исходному уровню в течение 1 минуты и дольше (рис. 48 а). Усиление свечения связано с увеличением кальцийаккумулирующей способности мембран обонятельных клеток под действием аммиака.

При обдувании препарата аммиаком на ЭОГ регистрировалась реакция в виде отрицательной волны, имеющей большую амплитуду и длительность (рис. 48 б). Так же, как и флуоресцентная реакция, электрический ответ медленно возвращался к исходному уровню. Кинетики обеих реакций оказалась сходной. Это факт дает основание думать, что они имеют общую природу.

На рис. 49 показано изменение флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ при обдувании обонятельной выстилки аммиаком в присутствии в среде 2 мМ раствора ЭГТА (n=6). Видно, что в бескальциевой среде одорант инициирует усиление свечения, причем амплитуда его на 15 отн. ед. больше, чем без ЭГТА. Сохранение реакции на одорант в отсутвие Са²⁺ в омывающем растворе свидетельствует о том, что в ее обеспечении принимает участие кальций из внутриклеточных депо. Этот факт указывает на принципиальную разницу в источнике поступления ионов кальция в ответ на стимуляцию одорантами первой группы и аммиаком. В отличие от аммиака, их рецепция обеспечивается входящими потоками кальция из внеклеточной среды.

Чтобы выявить источник поступления этого иона в цитозоль, препарат обрабатывали тапсигаргином (n=10), который является ингибитором АТФ-аз эндоплазматического ретикулума. За счет ингибирования происходит опустошение запасов ионов кальция в эндоплазматическом ретикулуме и повышение его содержания в цитозоле обонятельных клеток. Мы надеялись обнаружить усиление интенсивности флуоресценции при аппликации тапсигаргина на обонятельную выстилку, связанное с накоплением кальция в цитозоле и увеличением кальций-аккумулирующей способности мембран рецепторных клеток. Однако, как видно на рис. 50, тапсигаргин не инициировал повышения интенсивности флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ, подобного действию аммиака. Это означает, что в реакции на аммиак не участвует Са²⁺, аккумулированный в эндоплазматическом ретикулуме. Вместе с тем стимуляция аммиаком на фоне тапсигаргина увеличивала флуоресценцию, причем амплитуда ответа была выше той, которая регистрировалась в нативном препарате. Разница между ними такая же, как при действии одорантом на фоне ЭГТА. Следовательно, можно предположить, что усиление свечения комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ в обонятельных клетках вносит вклад Са²⁺, выходящий из других Са²⁺-депо, в, частности, из митохондрий.

Для проверки этого предположения обонятельную выстилку в течение 5 минут инкубировали в ротеноне и регистрировали ответ на него, а затем на аммиак, предъявляемый в его присутствии (n=6). Известно, что ротенон ингибирует клеточное дыхание в комлексе I переносчиков электронов в дыхательной цепи митохондрий, при этом митохондрии не аккумулируют кальций из цитозоля, что приводит к повышению его содержание там. На рис. 51 видно, что аппликация ротенона на препарат вызывала снижение интенсивности флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ, что принято связывать с уменьшением кальций-аккумулирующей способности мембран, обусловленным выходом Са²⁺ из внутриклеточных хранилищ. Следовательно, под действием ротенона кальций высвобождается из митохондрий в цитозоль.

Мы предположили, что в результате накопления кальция в цитозоле, индуцируемого высвобождением его из митохондрий под действием ротенона, повторные обдувания обонятельной выстилки одорантом должны снижать реакцию. Результаты опытов показали, что стимуляция аммиаком на фоне ротенона инициировала увеличение флуоресценции (рис. 52), однако при этом амплитуда ответа по сравнению с нативным препаратом снижалась на 30% при первом предъявлении стимула, в 3 раза – при втором, а затем исчезала. Снижение реакции вплоть до ее исчезновения может свидетельствовать, вероятно, о том, что действие аммиака и ротенона направлено на один источник поступления Са²⁺ в клетку – митохондрии.

Подтверждением этого предположения могли послужить эксперименты с применением протонофоров. Они разобщают окислительное фосфорилирование и деполяризуют органеллы. Снижение мембранного потенциала вызывает высвобождение аккумулированного кальция и повышение его содержания в цитозоле.

В качестве протонофора был использован FCCP (n=6). Его апплицировали на обонятельную выстилку и регистрировали ответ, а после 8 – 10 минутной инкубации обдували препарат аммиаком. Данные, представленные на рис. 53, показывают, что под действием FCCP интенсивность флуоресценции снижалась, что обычно связывают с уменьшением кальций-аккумулирующей способности мембран митохондрий, обусловленной выходом кальция из них.

Стимуляция аммиаком инициировала увеличение свечения (рис. 54), при этом амплитуда ответа при первом воздействии на 30% превышала таковую в интактных клетках, а при втором предъявлении стимула снижалась вплоть до исчезновения. Следовательно, это также может означать, что усиление флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ, вызываемое одорантом, связано с повышением содержания Са²⁺ в цитозоле за счет выхода из митохондрий.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что действие аммиака направлено на митохондрии, и, очевидно, в нем не участвуют внутриклеточные посредники.