1.3.3. Участие Golf-белка в рецепции одорантов

Известно, что активация аденилатциклазы в АЦ-пути трансдукции во всех типах клеток осуществляется через ГТФ-связывающий белок (G-белок). Он представляет собой периферический белок плазматической мембраны, гетеротример, состоящий из альфа,-бета- и гамма-субъединиц. Характерным свойством его является способность связывать с высоким сродством и специфичностью ГТФ и гидролизовать его до ГДФ. При этом происходит переход ГТФ-связывающего белка из активного в неактивное состояние. Главную роль в функционировании этих белков выполняет альфа-субъединица. Известно около 16 их изоформ. Именно она связывает и гидролизует ГТФ и определяет связывание G-белка с рецептором и эффекторными белками, одним из которых может быть аденилатциклаза. Именно альфа-субъединица является специфической для каждого ГТФ-связывающего белка. При связывании ГТФ происходит ее активация, и она приобретает способность регулировать эффекторные системы (Eyster, 1998). Реакцию замещения ГДФ на ГТФ в G-белках катализируют мембранные рецепторы. Бета- и гамма-субъединицы образуют комплекс, который необходим для того, чтобы произошло взаимодействие G-белка с рецептором и замещение ГДФ на ГТФ, а также для заякоревания альфа-субъединицы (Крутецкая, Лебедев, 1992, б; Авдонин, Ткачук, 1994; Крутецкая и др., 2003).

В обонятельном эпителии идентифицирован специфический для него G_olf-белок. Им особенно обогащены обонятельные жгутики в дистальной их части (Pace et al., 1985; Pace, Lancet, 1985; Lancet , 1986; Jones, Reed, 1989; Lazarovitz et al., 1989; Menco, Fоrbman, 1992; Новоселов и др., 1995). Авторами этих работ показано, что альфа-субъединица этого ГТФ-связывающего белка является полипептидом с молекулярной массой 42 кДа, который специфически модифицируется холерным токсином. Хотя его свойства сходны со стимуляторными G-белками в других тканях, он является особой разновидностью обонятельного эпителия, поскольку обладает уникальной для ольфакторного G-протеина конфигурацией ГТФ-связывающего сайта, а его альфа-субъединица способна стимулировать АЦ (Lancet, 1987; Jones, Reed, 1989; Ache, Zhainazarov,1995; Sinnarayah et al., 1998; Cabrera-Vera et al., 2003). В ходе эмбриогенеза ольфакторный G-белок экспрессируется на ранних стадиях, но после обонятельных рецепторов (Saito et al., 1998).

Таким образом, в обонятельной трансдукции перенос активности с ольфакторного рецептора на АЦ III обеспечивается чувствительным к холерному токсину стимуляторным специфическим ольфакторным ГТФ-связывающим протеином (G_olf).

1.3.4. Структура и функция циклонуклеотид-зависимых Са²⁺-каналов в обонятельных клетках

Стимуляция обонятельных клеток одорантами вызывала изменение проницаемости их плазмолеммы. На изолированных рецепторных клетках тритонов было показано, что действие на них амилацетата приводило к увеличению ионной проницаемости и деполяризации плазматической мембраны (Kurahashi, 1989; Kurahashi, Shibuya, 1989). Под дейстивем цинеола или амилацетата в обонятельных клетках лягушки или смеси одорантов из ацетофенона, амилацетата и цинеола в рецепторных клетках саламандры регистрировали входящие рецепторные токи (Reisert, Mattews, 1998; Zufall et al., 1991). Минор А.В. (1980) при послойном внеклеточном и внутриклеточном отведении токов от обонятельной выстилки показал, что вплоть до слоя тел обонятельных клеток внеклеточные токи входят в клетку.

В опытах на изолированных обонятельных клетках саламандр методом пэтч-клэмп были получены прямые доказательства того, что стимуляция смесями одорантов, содержащих амилацетат, цинеол и изобутилатоксипиразин, инициирует входящие катионные токи, локализованные в обонятельных жгутиках, которые деполяризуют их плазмолемму и генерируют рецепторный потенциал (Frings, Lindeman, 1988; Lowe, Gold, 1991; Reisert, Mattews, 1996; 1998 a,b; 2001).

Мембранная проницаемость в аденилатциклазном пути трансдукции может изменяться, по крайней мере, двумя путями. Одним из них является фосфорилирование канальных белков протеинкиназой, регилируемой цАМФ (ПКА). Этот фермент идентифицирован во всех типах клеток. В своем неактивном состоянии он состоит из двух регуляторных и двух каталитических субъединиц. Две молекулы цАМФ связываются с каждой регуляторной субъединицей, чтобы обеспечить возможность высвобождения каталитических субъединиц, которые и осуществляют перенос гамма-фосфата с АТФ на цитоплазматические или мембранные протеины (Eyster, 1998; Крутецкая и др., 2003). Поэтому можно было предполагать, что увеличение мембранной проницаемости обонятельных клеток для катионов под действием одорантов, активирующих АЦ, связано с активностью протеинкиназы А, тем более, что этот фермент обнаружен в обонятельных жгутиках (Lancet, 1987).

Однако при регистрации токов от цилиарных мембран было показано прямое открывание ворот ионных каналов под действием цАМФ (Nakamura, Gold, 1987; Frings et al., 1992). S. Frings and B. Lindemann (1991) наблюдали за изменением скорости спайков потенциалов действия в тонкослойном препарате обонятельной слизистой лягушки при повышении концентрации циклонуклеотида в клетке, вводимого в цитозоль через пэтч-пипетку или посредством аппликации форсколина и кофеина. Они пришли к выводу, что именно цАМФ вызывает градуальную деполяризацию мембраны, которая увеличивает скорость спайков. Эти данные были подтверждены на одиночных клетках саламандры и тритона (Kurahashi, 1990; Kurahashi et al., 1990; Lowe, Gold,1993), а также получены при внутриклеточной регистрации мембранного потенциала обонятельных клеток лягушек (Минор, Бызов, 1977). На изолированных обонятельных клетках саламандры методом пэтч-клэмп от одиночного канала было показано, что применяемые ими одоранты и вводимые в клетку циклические нуклеотиды активировали одинаковый входящий катионный ток. Таким образом, было получено прямое доказательство, что канал, открываемый пахучим агентом и цАМФ, представляет собой один и тот же канал (Firestein et al., 1991; Zufall et al., 1991).

Циклонуклеотид-регулируемые каналы являются неселективными катионными каналами, имеющими катионсвязывающий сайт высокой силы в области поры. Они имеют одинаковые свойства у лягушек и крыс, но отличаются от фоторецепторов и других тканей по таким важным свойствам, как относительная проницаемость для Са²⁺, переносимого через плазмолемму (Kaupp et al., 1991; Frings et al., 1992; Kurahashi, You, 1994; Frings et al., 1995). Плотность этих каналов в разных частях обонятельной клетки различна: их почти нет на соме и дендритах и более 1000 на пэтч в обонятельных жгутиках (Frings et al., 1992). Таким образом, было доказано, что обонятельная рецепция опосредуется катионными каналами, управляемыми циклонуклеотидами, то есть циклонуклеотид-регулируемыми каналами.

Характерным свойством этих каналов является слабая селективность по отношению к одновалентным катионами и несколько большая к кальцию (Frings et al., 1992; Kolesnikov et al., 1990). По имеющимся данным, в покое концентрация ионов кальция в обонятельных жгутиках достигает 40 нМ, а в булаве – 57 нМ. После стимуляции одорантами через 1 с содержание Са²⁺ повышается в обонятельных жгутиках, а затем, с задержкой около 300 мс его количество увеличивается в булаве и периферическом отростке обонятельной клетки (Menini, 1999). Сопоставление динамики кальция, вызванного форсколином, повышающим концентрацию цАМФ в цитозоле, и одорантом (цитралвой), привело к заключению, что ответ на стимуляцию одорантами связан с увеличением содержания цАМФ и ростом концентрации ионов кальция (Sato et al., 1991). Считают, что циклонуклеотид-регулируемые каналы сильнее связывают ионы кальция внутри поры, чем одновалентные ионы. Следовательно, они занимают канал в течение более длительного времени, посредством чего задерживают поток одновалентных ионов в клетку (Kaupp, 1991).

По мнению S. Frings et al. (1995), основная функция циклонуклеотид-регулируемых каналов заключается в обеспечении пути для входа кальция в клетку. При сочетании метода фиксации потенциала и фотометрии внутриклеточного кальция в фоторецепторах и обонятельных клетках они показали, что при физиологических концентрациях Са²⁺-ток вносит большой вклад в общий ток через этот канал. В обонятельной слизи лягушки содержание кальция вне клетки составляет около 8 мМ, но он находится в ней в связанном состоянии. Для реализации процесса обонятельной трансдукции достаточно 1 – 4 мМ внеклеточного кальция, при этом весь ток через плазмолемму обонятельных жгутиков переносится этим ионом без вклада Na⁺, также хорошо проникающего через данные каналы. Блокаторами цАМФ-зависимых каналов являются d-cis-дилтиазем, l-cis-дилтиазем и Д-600 (Frings, Lindemann, 1991).

Идентифицирован ген, кодирующий белок, входящий в состав ионных каналов, регулируемых циклическими нуклеотидами (Griff, Reed, 1995). Установлена аминокислотная последовательность полипептида этих каналов. Они являются типичными лиганд-управляемыми каналами. Эти каналы активируются непосредственно цАМФ (Zuffal et al., 1991; Frings et al., 1992; Zufall et al., 1997).

Cостав субъединиц, аминокислотная последовательность и трансмембранная топография этих каналов в обонятельных клетках не имеет сходства с другими типами лиганд-управляемых каналов. На сегодняшний день у позвоночных идентифицировано несколько различных субъединиц этого канала. Он является гетеротетрамерным комплексом, состоящим из четырех субъединиц, окружающих пору, расположенную в центре. Каждая субъединица состоит из шести трансмембранных сегментов с внутриклеточными амино- и карбокситерминальными доменами, которые являются доступными для цитозольных модуляторов. Нативные ольфакторные циклонуклеотид-зависимые каналы состоят из трех типов субъединиц: CNGA2, CNGA4 и CNGB1b, находящиеся в стехиометрии 2 CNGA2 : 1 CNGA4 : 1 CNGB1b. В процессе сборки каждая субъединица взаимодействует со своими соседями «голова к хвосту» в 4-кратной симметрии, благодаря чему субъединицы CNGA2 соединяются друг с другом, а CNGA4 и CNGB1b могут взаимодействовать только с CNGA2. Поэтому сначала образуются димеры CGNA2 – CNGA4 и CNGA2 – CNGB1b, а затем они объединяются в тетрамерный канал (Zheng, Zagotta, 2004). Субъединицы CNGA4 и CNGB1b в составе канала необходимы для усиления его чувствительности к Са²⁺-кальмодулиновой регуляции, важного сигнала обратной связи, вовлекаемой в обонятельную адаптацию (Yan et al., 1995; Molday, 1996; Peng et al., 2004).

Состав субъединиц обеспечивает большое функциональное разнообразие цАМФ-зависимых каналов и может влиять на такие его свойства, как проницаемость для кальция, селективность лиганда и чувствительность к циклонуклеотидам (Bradely et al., 1994; Menini, 1999; Matsuzaki et al., 1999).

Катионные каналы, регулируемые циклическими нуклеотидами, обладают сходными свойствами в зрительной и обонятельной системах. Гомология их белков составляет 60% (Kaupp, 1991; Kaupp et al., 1991). Однако замена аланина на треонин обеспечивает структурную основу для регуляции канала посредством цАМФ, а не цГМФ в обонятельных рецепторах (Kaupp, 1991).

С помощью биохимического анализа, молекулярного клонирования и функциональной экспресии был идентифицирован высокомолекулярный протеин с молекулярной массой 240 кДа, принадлежащий бета-субъединице этих каналов в фоторецепторах (Korschen et al.,1995). В цАМФ-зависимых каналах различают семь гидрофобных областей, 6 из которых могут представлять собой трансмембранный сегмент. Седьмая область около карбокси-конца содержит циклонуклеотид-связывающий сайт, который, как полагают, тоже является трансмембранным сегментом. Неожиданной особенностью этих каналов оказалось наличие аминокислотной последовательности с участком, который в потенциалзависимых ионных каналах выполняет роль сенсора напряжения ( Kaupp, 1991). Функция его пока неизвестна.

Посредством световой микроскопии иммуногистохимическими методами было установлено, что циклонуклеотид-зависимые катионные каналы специфически локализуются в цилиарной области рецепторных клеток, и их нет в микровиллах опорных клеток и в ресничках респираторного эпителия. Цилиарная локализация каналов данного типа была подтверждена при иммуноэлектронномикроскопическом анализе ультраструктуры обонятельных жгутиков (Matsuzaki et al., 1999). Причем в ходе эмбрионального развития они появляются довольно рано (Е19): сразу после экспресии ГТФ-связывающих протеинов (Saito et al., 1998; Matsuzaki et al., 1999).

Преимущественная локализация цАМФ-каналов в цилиях (в дистальных их участках) рецепторных клеток проявляется и в том, что плотность их в мембране жгутиков обонятельных клеток тритона составляет 920 каналов на 1 мм², а у жабы – 2400 каналов на 1 мм², тогда как в дендрите и соме выявлено всего 2 канала на 1 мм² у тритона и 6 каналов на 1 мм² у жабы (Kurahashi, Kaneko, 1991). По данным G. Lowe and G.H. Gold (1993), плотность этих каналов в соме в 800 раз ниже, чем в жгутиках.

На основе всех изложенных данных была создана современная теория обоняния, согласно которой восприятие запахов разного качества осуществляется мембранными рецепторными комплексами, сопряженными с внутриклеточной сигнальной системой цАМФ. Основным ферментом этого пути является аденилатциклаза III типа, сопряженная с G_olf-белком. Ее активация приводит к гидролизу АТФ и синтезу цАМФ, который открывает в плазматической мембране обонятельных жгутиков кальциевые каналы, вызывая деполяризацию плазмолеммы и генерацию рецепторного потенциала (Lancet, 1997). Все компоненты механизма обонятельной трансдукции сосредоточены в обонятельных жгутиках, что свидетельствует о явном разделении функций между ними и сома-дендритическими компартментами: цилиарный аппарат выполняет специализированную роль сигнальной трансдукции, а сома служит для регулирования потенциала покоя и генерации потенциалов действия (Минор, 1980; Maue et al., 1987; McClintock, Ache, 1989; Firestein et al., 1990; Firestein, 1991).

Следует отметить, что в обонятельных жгутиках сосредоточены также механизмы, связанные с прекращением реакции на стимул. В частности, здесь присутствуют компоненты Nа⁺-зависимого выведения ионов кальция, обеспечивающего возвращение его концентрации к уровню покоя. На изолированных обонятельных клетках лягушки показано, что Na⁺-Ca²⁺-обмен играет важную роль в формировании реакции на одорант в рецепторных клетках (Reisert, Matthews, 1998; 2001). Кроме того, в цилиарной мембране сосредоточена Са²⁺-АТФаза, активность которой в этой области в 8 раз выше, чем в булаве обонятельной клетки (Roads et al., 1989). В обонятельных жгутиках крыс выявлена также киназа 3 рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающим белком. Эта киназа после активации протеинкиназой А или С фосфорилирует рецептор, в результате чего он разобщается с G-белком, и реакция на стимул прекращается. Этот феномен получил название агонист-опосредованной десенситизации (Peppel et al., 1997).

По описанному выше механизму осуществляется рецепция большого числа одорантов.

Однако эксперименты, проведенные на одиночных изолированных рецепторных клетках, не подтверждают такое единообразие физико-химических процессов, участвующих в обонянии. Из 3500 тестируемых клеток мышей 226 реагировали на какой-либо из предъявляемых одорантов, из которых только две клетки отвечали на гераниол, а шесть – на лираль (Tаuchara et al., 1999).

При внеклеточной регистрации токов от отдельных обонятельных клеток крыс стимуляция их 17 чистыми пахучими веществами выявила возбуждение в 53,5%, торможение в 5%, а отсутствие ответа на одоранты в 41,5% клеток (Duchamp-Viret et al., 1999).

Электрическая активность одиночных клеток, инициируемая повышением цАМФ в цитозоле, зависит от того, каким путем достигается это повышение. Оказалось, активация аденилатциклазы форсколином, ингибирование фосфодиэстеразы и введение мембранопроникающих аналогв цАМФ вызывали ответы с разным латентным периодом и амплитудой, причем, как тормозные, так и возбуждающие (Lowe et al., 1989; Frings et al., 1992). Можно предположить, что различия в регистрируемых реакциях обусловлены разными пулами цАМФ, каждый из которых контролируется своим сигнальным механизмом, и, следовательно, включает свои сигнальные процессы. Тем более, что компонентам аденилатциклазного пути свойственна высокая степень их пространственной организации, что определяет специфичность действия цАМФ, в частности, путем компартментализации протеинкиназы А с различными внутриклеточными белками, в том числе и ионными каналами (Крутецкая и др., 2003).

Из анализа литературных данных следует, что большая часть исследований механизмов обонятельной трансдукции проведена с использованием смесей одорантов. Но оказалось, что при стимуляции изолированных обонятельных клеток смесями одорантов, каждый компонент которой вовлекает в рецепцию цАМФ, из большого числа тестируемых клеток очень небольшая их часть способна реагировать на них (Firestein et al., 1990; Dione, 1991; Dionne, 1998; Dubin, Dionne, 1994).

По мнению S. Firestein et al. (1990), высокая неоднородность ответов связана с применением смесей. Известно, что анализ обонятельной рецепции возможен только в случае примерно одинаковой интенсивности запахов веществ, образующих смесь. Если интенсивность запаха одного из компонентов больше другого, то более сильный запах подавляет слабый. В таком случае запах смеси ничем не отличается от аромата более сильно пахнущего одоранта (Мазитова и др., 1966; Jinks, Laing, 2001).

Можно предположить, что в «нечувствительных» к смеси клетках нет обонятельного рецептора ни к одному из компонентов смеси или к тому из них, запах которого доминирует в данной смеси. Возможно, механизмы рецепции каждого компонента смеси в отдельности и всей смеси не идентичны. Известно, что запах смеси приобретает в большинстве случаев новые качества, не свойственные ее компонентам. Слиться между собой могут не только близкие по своему характеру запахи, но и весьма различные. Так, например, комплекс феромонов обонятельные рецепторы жука короеда-типографа воспринимают как качественно новую самостоятельную одорантную единицу (Скиркявичус и др., 1982).

Под действием смешанных пахучих веществ в одних и тех же обонятельных клетках регистрируются как возбуждение, так и тормозные реакции (Firestein et al., 1990; Dionne, 1992; Dubin, Dionne, 1993). Считают, что торможение является следствием стимуляции смесями, даже если один из их компонентов возбуждающий или нейтральный. Такой феномен получил название «mixture interactions» (Duchamp-Vioret et al., 2000). Известно, что смеси химических веществ для мух являются более аттрактивными, чем одиночный аттрактант, и природные, а не синтезированные, продукты гораздо более эффективные одоранты или репелленты (Brown et al., 1961; Mulla et al., 1977).

Таким образом, исследование механизмов обонятельной трансдукции с использованием смешанных запахов не позволяет достоверно определить эти механизмы.

В то же время каждый из одорантов может обладать своеобразным механизмом трансдукции в обонятельной клетке. Так, амилацетат в ничтожной концентрации (1 нМ) изменяет мембранный потенциал в липосомах, не содержащих систему цАМФ (Nomura, Kurihara, 1989; Enomoto et al., 1991). Следовательно, как полагают авторы, и деполяризация обонятельной клетки может происходить без участия цАМФ. Некоторые пахучие вещества вызывают реакции в рецепторных клетках независимо от ГТФ-связывающего белка – за счет адсорбции на липидных слоях (Janiguchi et al., 1994).

Несмотря на то, что в обонятельных клетках идентифицированы основные компоненты внутриклеточной сигнальной системы цАМФ, показана возможность их участия в трансдукции некоторых обонятельных стимулов, отсутствуют работы, в которых прослежена вся цепь последовательных процессов, возникающих в ответ на один типичный одорант.