4.5. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков

Гетерогенность проявилась и при исследовании изменений двигательной активности обонятельных жгутиков.

Наблюдая за характером их двигательной активности, мы убедились, что в покое, без воздействия пахучих веществ, они совершают спонтанные движения. Дистальный конец жгутика лишен тубулярного цитоскелета, а, следовательно, молекулярных механизмов подвижности (Бронштейн, 1977; Menco, Farbman, 1984; Matsuzaki et al., 1999). Активные процессы в проксимальном отделе обеспечивают сложную траекторию пассивного движения дистальных зон жгутиков обонятельных клеток (Бронштейн, 1977). Это означает, что основная роль в обеспечении спонтанной двигательной активности принадлежит микротрубочкам цилиарного аппарата в проксимальной части жгутика.

Мы предположили участие в изменениях жгутиковых движений под действием одорантов актинового компонента цитоскелета, который обнаруживается во всех клетках, включая простейшие, но не описан в составе обонятельных клеток. Для проверки этого предположения мы под непрерывным визуальным контролем в течение 40 минут обрабатывали обонятельную выстилку цитохалазином, препятствующим полимеризации F-актина. На рис. , в примембранном слое обонятельных жгутиков видны скопления глыбок разрушенного F-актина, выявляемого с помощью родоминфоллоидина - флуоресцентной метки на его полимеризованное состояние. Однако спонтанные движения обонятельных жгутиков при этом не изменялись. Следовательно, актиновая составляющая их цитоскелета не вовлекается в неупорядоченную двигательную активность при отсутствии пахучего стимула.

В ходе исследований влияния одорантов на характер движений жгутикового аппарата в наших опытах было обнаружено, что стимуляция обонятельной выстилки амиловым спиртом, камфорой, цинеолом, амилацетатом, ванилином и аммиаком ускоряла движения. При этом направленно и активно начинали двигаться дистальные участки обонятельных жгутиков. Появление у них способности к самостоятельной подвижности может быть обеспечено организацией здесь цитоскелета, подобно тому, как это происходит при образовании псевдоподий в градиенте концентрации хемоаттрактантов у одноклеточных организмов и лейкоцитов.

Для выяснения этого предположения мы сначала обонятельную выстилку стимулировали одним из одорантов, а затем обрабатывали родоминфоллоидином. Флуоресценция выявлялась в примембранной области и простиралась по всей длине обонятельных жгутиков, включая и весь дистальный отдел (рис. 69). Это, вероятно, означает, что при стимуляции пахучим агентом обонятельных клеток в них формируется актиновый цитоскелет, обеспечивающий жгутикам, при наличии миозиноподобных белков, выявленных в них А.А. Бронштейном (1966, 1977), активные движения, которые, очевидно, направлены на активный поиск одорантов в обонятельной слизи.

Механизмы реорганизации цитоскелета в обонятельных жгутиках неизвестны. О них можно высказывать только предположения, основанные на аналогии с взаимодействием хемоаттрактантов с одноклеточными организмами и лейкоцитами. В них, как и в обонятельных клетках, стимуляция химическими веществами запускает цепь внутриклеточных реакций с участием посредников. Они инициируют перестройку цитоскелета, обеспечивающую направленное движение одноклеточных организмов и лейкоцитов.

Показано (Bokoch, 2003), что для детекции хемоаттрактантов используются сигнальные пути, сопряженные с G-белком, причем основная роль принадлежит его бета-гамма-субъединице. Стимуляция G-белка обеспечивается взаимодействием лиганда с мембранным рецептором, 7 раз пронизывающим мембрану. В результате этого быстро и кратковременно увеличивается вход кальция, повышается содержание IP₃, цАМФ, цГМФ. Такой же механизм присущ и обонятельным клеткам в процессе обонятельной трансдукции.

У амеб и лейкоцитов следствием их стимуляции является как фосфорилирование миозинов I и II, так и индуцирование хемоаттрактантами полимеризации F-актина. Важно отметить, что процессы, связанные с реорганизацией цитоскелета, локализуются в определенной области. Рецепторы, G-белки, актин-связывающие белки филоподин (гомолог талина), кофилин, коронин и протеин, ассоциированный с аденилатциклазой, аккумулируются на ведущем конце клеток. Ремоделирование актинового цитоскелета может опосредоваться активацией Rho-семейства малых GTPаз (Parent, Devreotes, 1999). Благодаря им осуществляется ассоциация цитоскелета с мембранами на ведущем конце клетки.

Помимо реорганизации актинового цитоскелета, под действием хемоаттрактантов изменяется и миозиновый. В этом процессе участвует цГМФ, который способствует транслокации тяжелой цепи миозина II к клеточному кортексу (Paren, Devreotes, 1999).

Непосредственную модуляцию динамики актинового цитоскелета осуществляет и фосфоинозитол 4,5-бифосфат (PI4,4P2), который играет ключевую роль в регуляции полимеризации актина на мембранном сайте. Он cинтезируется под действием фосфатидилинозитолфосфаткиназы, выполняющей доминирующую регуляторную функцию актинового цитоскелета. Свою регуляторную функцию этот фосфоинозитид осуществляет посредством локального изменения своего синтеза на плазмолемме. Он рекрутирует актин-связывающие протеины к определенным субклеточным областям и изменяет активность и динамику актина посредством модуляции путей сигнальной трансдукции и активности актинсвязывающих протеинов, Rho, Rac и Arf (Doughmann et al., 2003; Yin, Janmey, 2003).

Сложный процесс перестройки цитоскелета направлен на обеспечение направленного движения клеток в градиенте концентрации химических веществ. Возможно, и в обонятельных жгутиках под действием одорантов происходит полимеризация F-актина с участием внутриклеточных сигнальных систем.

Обработка обонятельной выстилки ротеноном прекращает их локомоторную активность, что свидетельствует о необходимости митохондриального синтеза АТФ для энергетического обеспечения подвижности обонятельных жгутиков. Если обонятельную выстилку, обработанную ротеноном, стимулировать амиловым спиртом, камфорой, цинеолом, амилацетатом, ванилином и аммиаком, то двигательная активность жгутикового аппарата восстанавливается. Следовательно, одоранты снимают ингибирующее действие ротенона. Эта способность не присуща сероводороду. Он не только не восстанавливает движения жгутиков на фоне ротенона, но и сам способен их прекращать. По-видимому, он ингибирует как дыхание, так и анаэробный гликолиз, полностью подавляя синтез АТФ в обонятельных клетках.

Восстановление двигательной активности обонятельных жгутиков амиловым спиртом, камфорой, цинеолом, амилацетатом, ванилином и аммиаком на фоне его угнетения ротеноном заставляет предположить, что перечисленные одоранты способны действовать через ротенон-резистентный путь восстановления пиридиннуклеотидов. В опытах на других тканях было установлено, что такой путь может обеспечиваться сукцинатом (Лукьянова и др., 1982). В пользу нашего предположения о роли сукцината на фоне угнетения двигательной активности обонятельных жгутиков ротеноном говорят данные о высокой активности сукцинатдегидрогеназы в булаве апикального отростка обонятельной клетки земноводных (Бронштейн, 1977).

Сукцинатдегидрогеназа остается активированной даже при снижении уровня цитозольного кальция (Rassmussen, Barret, 1988), так как концентрация этого иона в митохондриальном матриксе остается повышенной в течение десятков секунд после того, как его уровень в цитоплазме возвращается в исходное состяние (Hzjnoczky et al., 1995; White, Reinolds, 1997; Drummond et al., 2000; Duchen, 2000; Rizzuto et al., 2000). Видимо, поэтому при стимуляции обонятельных клеток амиловым спиртом, камфорой, цинеолом, амилацетатом и ванилином продолжительность усиления собственной флуоресценции НАДН и ФП была гораздо дольше, чем флоуоресценция комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ, то есть процесс активации митохондриального дыхания был продолжительнее, чем изменение кальций-аккумулирующей способности.

Таким образом, рецепция разнородных пахучих веществ является гетерогенным процессом, который включает механизм обонятельной трансдукции, сопряженный с изменением активности дыхательной цепи митохондрий и биомеханическими преобразованиями жгутикового аппарата обонятельных клеток. При этом рецепция одорантов, обладающих качественно разными запахами, обеспечивается посредством неоднородных физических и химических процессов. Следовательно, не только вкусовой, каротидной и медуллярной, но и обонятельной рецепции присуща гетерогенность молекулярных механизмов.