Глава 4. Обсуждение результатов

4.1. Исследование внутриклеточных сигнальнх систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина

При стимуляции обонятельной выстилки амиловым спиртом, камфорой, цинеолом, амилацетатом и ванилином флуоресценция комплекса: Са²⁺-ХТЦ –КМ становилась сильнее. Это связано, по-видимому, с повышением кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных жгутиков, поскольку было показано, что усиление свечения комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ идет параллельно с аккумулированием кальция клеточными мембранами (Hallet et al., 1972; Поглазов и др., 1975; Dixon et al., 1984; Самойлов, 1985). При этом изменения вторичной флуоресценции, инициированные одорантами в обонятельных клетках, коррелировали с динамикой электроольфактограммы.

Способность мембран аккумулировать ионы кальция обусловливается кальцийсвязывающими белками, локализованными в плазмолемме и на внутренней поверхности мембран, принимающими участие в модуляции сигнала. Различают три типа протеинов, ассоциированных с мембранами: Са²⁺-насос, Na⁺/Ca²⁺-обменник и Са²⁺-связыващие белки кальциевых каналов. Первые два типа, вероятно, не вносят существенного вклада в начальное повышение содержания внутриклеточного кальция, так как у Na⁺/Ca²⁺-обменника низкое сродство к Са²⁺, а Са²⁺-насос более инерционный по сравнению с ним (Khana et al., 1988).

Поэтому, можно предположить, что в интенсивность флуоресценции в наших опытах основной вклад вносит Са²⁺ в кальциевых каналах, так как, по данным Ю.А.Владимирова и Г.Е.Добрецова (1980), интенсивность свечения определяется трансмембранным переносом этого иона, связанным с внутреней поверхностью мембран.

Из тотальной концентрации внутриклеточного кальция, (около 100 мкМ), только 10 - 100 нМ приходится на свободный Са²⁺ (Khana et al., 1988). Способность цитоплазмы забуферевать этот ион, в частности, с помощью кальций-связывающих белков, для которых свойственна компартментализация в клетке, означает, что изменения свободного кальция могут быть локализованы внутри клетки, то есть пространственно ограничены в ней, причем Са²⁺ свободно не диффундирует по цитозолю из области, где его содержание увеличилось. Это дает основание предполагать, что регистрируемые нами изменения интенсивности флуоресценции в ответ на стимуляцию одорантами могут характеризовать изменения кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных жгутиков, а не всей клетки, поскольку именно в них сосредоточены компоненты обонятельной трансдукции, вплоть до Са^2+-каналов, возле которых и образуются зоны с повышенным содержанием этого иона.

В присутствии 2 мМ ЭГТА, связывающего внеклеточный кальций, реакция на воздействие амиловым спиртом, амлацетатом, цинеолом, камфорой и ванилином исчезала. Следовательно, усиление свечения обонятельного эпителия в ответ на одоранты обусловлено входом Са²⁺ из внеклеточной среды в цитозоль. Приведенные данные подтверждаются исследованиями на изолированных рецепторных клетках, в которых стимуляция смесями цинеола-амилацетата-ацетофенона инициировала вход этого иона в клетки (Winegar et al., 1988; Restrepo et al., 1990; Sato et al., 1991; Restrepo et al., 1992). Благодаря входящему кальциевому току, инициируемому смесями, содержащими цинеол и амилацетат, плазмолемма обонятельных жгутиков деполяризуется (Frings, Lindemann 1988; Zufall et al., 1991).

Вход кальция из интерстиция возможен по кальциевым каналам в плазмолемме. Известно, что ионные каналы могут открываться при непосредственном взаимодействии с ними внутриклеточных посредников. Лиганд-зависимые каналы, регулируемые IP₃ и цАМФ, обнаружены в обонятельных клетках многих типов животных. Они представляют собой неселективные ионные каналы, проницаемые преимущественно для ионов кальция (Frings et al., 1991; 1992; Lowe, Gold, 1993; Okada et., 1994; Matsuzaki et., 1999).

Мы предположили, что в обонятельную трансдукцию перечисленных одорантов может вовлекаться цАМФ. Для проверки такого предположения препарат обонятельной выстилки обрабатывали 10 мкМ раствором дилтиазема – блокатора Са²⁺-каналов, регулируемых цАМФ (Frings, Lindemann, 1991; Косолапов, Колесников, 1992). В таком случае реакции на амиловый спирт, амилацетат и цинеол исчезали, тогда как на камфору и ванилин сохранялись. Данный факт свидетельствует, что свечение комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ под действием веществ, обладающих прогорклым, фруктовым и эвкалиптовым запахами, возрастает благодаря входу кальция через цАМФ-зависимые каналы, в то время как под действием агентов, имеющих камфорный и цветочный аромат, эти каналы не открываются.

Одним из механизмов повышения концентрация цАМФ в цитозоле может быть ингибирование фосфодиэстеразы (ФДЭ). При воздействии ингибиторов ФДЭ на обонятельные клетки флуоресценция комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ должна усиливаться, как и под действием одорантов. Из литературных данных известно, что цинеол и амилацетат вовлекают в рецепцию аденилатциклазу, а не фосфодиэстеразу (Минор, Сакина, 1973; Frings, Lindemann, 1989; Firestein et al., 1990; Lowe, Gold, 1991; Zufall et al., 1991; Lowe, Gold, 1993; Kawai et al., 1997; Reisert, Mattews, 1998; Sinnarajah et al., 1998; Kawai, 1999; Duchamp-Viret et al., 2000). Поэтому роль ФДЭ мы не стали исследовать для всех используемых нами одорантов, а только в рецепции камфоры и амилового спирта. Для этого обонятельную выстилку инкубировали в 100 мкМ растворе кофеина – ингибиторе фосфодиэстеразы и регистрировали ответ на него. Реакции на повышение концентрации цАМФ в цитозоле, сходной с реакцией на стимуляцию камфорой или амиловым спиртом, не наблюдалось. Следовательно, в рецепции камфоры и амилового спирта этот фермент не участвует, и вход ионов кальция в обонятельную клетку, стимулированную амиловым спиртом и камфорой не инициируется повышением цитозольного содержания цАМФ в результате ингибирования фосфодиэстразы.

Вместе с тем показано, что ингибиторы ФДЭ влияют на длительность и амплитуду суммарного рецепторного потенциала обонятельной выстилки (Menevse et al., 1977). В наших опытах при обдувании ее амиловым спиртом на фоне кофеина интенсивность флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ превышала реакцию нативного препарата. Полученный факт свидетельствует, что при повышении внутриклеточного содержания цАМФ посредством ингибирования ФДЭ увеличивается кальций-аккумулирующая способность мембран обонятельных клеток. Однако это связано, вероятно, не с непосредственным открыванием Са²⁺-каналов, а с тем, что более высокая концентрация циклонуклеотида внутри клетки увеличивает проводимость циклонуклеотид-зависимых каналов, способствуя увеличению кальциевой проницаемости (Lynch, Lindemann, 1994).

Следует, однако, отметить, что такой механизм регуляции проницаемости через цАМФ-каналы, вероятно, присущ только ФДЭ. В опытах, проведенных с аппликацией форсколина, тоже увеличивающего содержание цАМФ в цитозоле, но посредством активации аденилатциклазы, реакции на амиловый спирт не было.

Через систему цАМФ может также осуществляться регуляция рецептора к инозитол-1, 4, 5-трифосфату. На срезах мозга показано (Haug, 1999), что протеинкиназа А фосфорилирирует его. Вероятно, этим можно объяснить наблюдаемое в наших опытах ускорение реакции обонятельных клеток на камфору, предъявляемую после обработки обонятельной выстилки 100 мкМ раствором кофеина.

Другим путем повышения внутриклеточного цАМФ является активация аденилатциклазы (Авдонин, Ткачук, 1994; Крутецкая и д.р. 2003). Ее участие доказано в обонянии большого числа одорантов (Saito et al., 1998; Sinnarajah, 1998; Matsuzaki et al., 1999). Авторы исследований применяли смеси пахучих веществ, в состав которых входили и такие, которыми пользовались мы в своих экспериментах. Поскольку механизм трансдукции смеси может отличаться от каждого из ее компонентов, то роль аденилатциклазы мы определяли в отдельности для каждого из применяемых нами одорантов.

Для выявления АЦ-пути в рецепции пахучих веществ стимулировали ими обонятельную выстилку на фоне 2,5-дидеоксиаденозина – ингибитора аденилатциклазы. В таком случае реакция на амиловый спирт, цинеол и амилацетат исчезала, тогда как на камфору и ванилин сохранялась. Данный факт свидетельствует, что в обонянии агентов, обладающих прогорклым, эвкалиптовым и фруктовым запахами, участвует аденилатциклаза, а в рецепцию камфорного и цветочного ароматов этот фермент не вовлекается.

Еще одним приемом для выявления роли этого фермента в наших опытах с амиловым спиртом было применение 10 мкМ раствора форсколина – активатора АЦ. Аппликация его на обонятельную выстилку вызывала усиление флуоресценции, подобное амиловому спирту. Сходство реакций на разные агенты может свидетельствовать о сходном механизме действия амилового спирта и форсколина. По-видимому, одоранты, обладающие прогорклым, а также фруктовым и эвкалиптовым запахами, активируют аденилатциклазу.

Таким образом, эти факты свидетельствуют о том, что именно активация аденилатциклазы, а не ингибирование ФДЭ усиливает синтез цАМФ при стимуляции обонятельной выстилки амиловым спиртом, цинеолом и амилацетатом. На это указывает как потеря чувствительности к амиловому спирту, амилацетату и цинеолу при ингибированной АЦ, так и сходство реакций на форсколин и амиловый спирт. Данный факт, в свою очередь, означает, что в рецепцию прогорклого, фруктового и эвкалиптового запахов включается внутриклеточная сигнальная система цАМФ.

В рецепцию камфорного и цветочного запахов аденилатциклаза не вовлекается.

Оказалось, если препарат обработать 100 мкМ раствором кофеина, а затем стимулировать камфорой, интенсивность флуоресценции быстрее достигала максимального значения и раньше возвращалась к исходному уровню. Такая реакция указывает на то, что циклические нуклеотиды играют определенную роль в рецепции камфорного запаха. Повышение цитозольного содержания цАМФ по механизму ингибирования фософдиэстеразы ускоряло ответ на камфору. Следовательно, циклонуклеотиды могут влиять на кинетику реакции на этот одорант. Однако непосредственного участия в механизме открывания Са²⁺-каналов в плазмолемме обонятельных жгутиков они не принимают, так как реакций на кофеин, сходных с действием камфоры, мы не наблюдали. Данный факт лишний раз свидетельствует, что система цАМФ не вовлекается в рецепцию одорантов, обладающих камфорным запахом.

Из сказанного следует, что в отличие от амилового спирта, цинеола и амилацетата, аденилатциклаза, а, следовательно, и система цАМФ, не вовлекаются в трансдукцию камфоры и ванилина. Стимуляция ими обонятельной выстилки, обработанной 30 мкМ раствором рутениевого красного – блокатора Са²⁺-каналов, открываемых IP₃, не вызывала реакций обонятельных клеток. Отсутствие чувствительности к раздражителю на фоне рутениевого красного указывает на то, что вход кальция в рецепторные клетки осуществляется через IP₃-регулируемые каналы.

Данные о наличии IP₃-зависимых Са²⁺-каналов в плазмолемме обонятельных жгутиков расширяют представление о роли каналов данного типа в функционировании клеток. В настоящее время основное внимание многих исследователей сосредоточено на изучении таких каналов, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме. Они предназначены для участия в депо-зависимом входе Са²⁺ в клетки различного типа (Крутецкая, Лебедев, 1992 а; Крутецкая и др., 2003). Вероятно, в обонятельной трансдукции такого механизма повышения содержания кальция в цитозоле нет. На это указывают не только наши данные. На одиночных обонятельных клетках мыши показано (Tauhara et al., 1999), что тапсигаргин не вызывал реакцию, подобную лиралю, из чего был сделан вывод, что в обоняние этого одоранта не вовлекается депо-зависимый вход кальция. Кроме того, для реализации такого входа, как полагают, плазмолемма обонятельной клетки и мембрана эндоплазматического ретикулума должны находиться на достаточно близком расстоянии (Rizzuto et al., 1993; 1994; 2000). Вместе с тем эндоплазматический ретикулум в обонятельных жгутиках не обнаружен (Бронштейн, 1966; 1977; Винников, 1979).

Известно, что 1,4,5-трифосфоинозитиды образуются в результате гидролиза мембранных инозитолфосфатов активированной фосфолипазой С (Крутецкая, Лебедев, 1992 а; Авдонин, Ткачук, 1994, Крутецкая и др., 2003). В наших опытах реакция обонятельной выстилки на ванилин исчезала после обработки ее неомицином – ингибитором фосфолипазы С, основного фермента фосфоинозитидной сигнальной системы. Полученные данные говорят о вовлечении фосфоинозитидного пути передачи сигнала в ответ на стимуляцию камфорой и ванилином, причем синтез IP₃ при этом, вероятно, обеспечивается активацией фосфолипазы С.

Рассматривая в совокупности результаты фармакологического анализа обонятельной трансдукции, мы пришли к выводу о том, что в рецепторные процессы, обеспечивающие восприятие веществ, обладающих разными запахами, вовлекаются различные сигнальные системы: в рецепцию веществ, с прогорклым, эвкалиптовым и фруктовым запахами, – цАМФ, а в рецепцию одорантов с камфорным и цветочным запахами – IP₃. Важно отметить, что хотя камфора и цинеол входят в состав одной и той же группы химических соединений – монотерпенов, они обладают разными запахами, а в механизме их трансдукции участвуют разные сигнальные системы обонятельных клеток. Таков первый аспект гетерогенности обонятельной рецепции.

Активация ионных каналов может осуществляться протеинкиназами: ПКА или ПКС (Авдонин, Ткачук, 1994; Крутецкая и др., 2003). Роль этих ферментов в рецепции данных одорантов мы исследовали, используя Н-7 – ингибитор ПКА и ПКС. Обонятельные клетки, подвергнутые воздействию Н-7, сохраняли способность реагировать на последующую стимуляцию одорантами. Следовательно, протеинкиназы не участвуют в обонянии амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина, и не они активируют ионные каналы для входа кальция в цитозоль при действии перечисленных одорантов.

Активация ключевых ферментов сигнальных путей обеспечивается сопряженными с ними специфическими ольфакторными G-белками (Golf) (Pace et al., 1985; Jones, Reed, 1989; Okada et al., 1994; Matsuzaki et al., 1999). Чтобы определить их участие в рецепции одорантов, мы регистрировали реакцию обонятельной выстилки на фторалюминат. Он является специфическим мембранопроникающим активатором G-белков, действующим на них, минуя мембранные рецепторы (Крутецкая, Лебедев, 1992 а, б).

Аппликация AlF₄^- на обонятельную выстилку вызывала усиление флуоресценции, подобное реакциям на амиловый спирт, амилацетат и ванилин, а вот реакции, сходной с действием камфоры, не наблюдалось. Ответ рецепторных клеток на фторалюминат, подобный ответам на амиловый спирт, амилацетат и ванилин может означать, что механизм действия предъявляемых пахучих веществ и AlF₄^-аналогичен. По-видимому, амиловый спирт, амилацетат и ванилин активируют ключевые ферменты, сопряженные с G-белком, который, обеспечивая реакции на амиловый спирт и амилацетат, передает сигнал на аденилатциклазу, а при реакциях на ванилин – на фосфолипазу С. В рецепцию камфоры и, возможно, цинеола, этот белок не включается.

Из результатов этих опытов следует, что гетерогенность обонятельной трансдукции проявляется и в том, что при участии в рецепции различных одорантов одной и той же сигнальной системы ее компоненты могут быть различными. Так, камфора и ванилин активируют фосфоинозитидный путь, но ванилин действует через G-белок, а камфора вовлекает другой путь передачи информации на эффекторный белок. В рецепции амилового спирта, амилацетата и цинеола участвует аденилатциклаза, но в реакциях на первые два одоранта она сопряжена с G- белком, а активация ее цинеолом связана с другим механизмом.

Камфора и цинеол входят в одну и ту же группу химических соединений. Поэтому мы предположили, что механизм передачи информации на эффекторные молекулы обеспечивают для них активированные рецепторные тирозинкиназы. Известно, что они при активации могут стимулировать аденилатциклазу и фосфолипазу С (Крутецкая, Лебедев, 1998; Крутецкая и др., 2003).

Наличие рецепторных тирозинкиназ в обонятельных клетках, вероятно, исключать нельзя, поскольку в апикальных отростках обонятельных клеток обнаружен фактор роста нервов (Aiba et al., 1993), а известно, что тирозинкиназные рецепторы играют ведущую роль в процессах роста клеток. Но процессы фосфорилирования/дефосфорилирования тирозина являются общим элементом путей внутриклеточной сигнализации, запускаемых различными агентами (Крутецкая, Лебедев, 1998; Крутецкая и др., 2003), возможно, и одорантами.

Для проверки данного предположения обонятельную выстилку инкубировали в 100 мкМ растворе генистейна – одном из природных ингибиторов тирозинкиназ. При стимуляции обонятельных рецепторов камфорой и цинеолом на фоне этого ингибитора они утрачивали способность реагировать на данные пахучие вещества. Следовательно, выключение тирозинкиназ из процесса передачи сигнала подавляет реакцию на камфору и цинеол. Для рецепции веществ с камфорным и эвкалиптовым запахами необходимо участие тирозинкиназы, передающей сигнал далее на разные эффекторные белки: фосфолипазу С для камфоры, аденилатциклазу – для цинеола.

Как видно, входя в общую группу химических соединений (они являются монотерпенами), камфора и цинеол запускают одинаковый механизм трансмембранной сигнализации: активацию тирозинкиназ. Однако далее их пути расходятся. В рецепцию камфоры включается фосфоинозитидная сигнальная система, тогда как восприятие цинеола, который по классификации запахов принадлежит камфорным запахам, но пахнет не камфорой, а душистым эвкалиптом, обеспечивается системой цАМФ. И это еще одно проявление гетерогенности обонятельной рецепции.

Камфора и цинеол влияют на рост организмов (Westalke et al., 1999; Abrahim et al., 2000). Следует, однако, отметить, что в наших опытах камфора и цинеол проявляли свойства пахучих веществ, а не агентов, влияющих на другие функции клетки, в частности, на их рост. Наши эксперименты по исследованию сигнальных систем, участвующих в обонянии этих одорантов, выявили очень короткие времена, в течение которых реакция на стимуляцию достигает максимальных значений. Это время укладывается в 3 – 5 с для камфоры и в 10 с – для цинеола. Между тем, показано, что факторы роста стимулируют фосфорилирование протеинов, гидролиз фосфоинозитидов и ионные потоки через плазмолемму через несколько минут после их добавления. Митотический ответ развивается через 20 часов (Whitman, Cantley, 1988). Таким образом, фосфорилирование белков по тирозину хоть и является событием более редким, чем фосфорилирование по серину, оно, вероятно, может участвовать не только в процессах клеточного роста, пролиферации и дифференцировки, но и в обонятельной трансдукции одорантов.

Установленные факты гетерогенности обонятельной трансдукции представлены в обобщенном виде на рис. В обонятельных клетках, реагирующих на амиловый спирт или амилацетат, каждый из названных одорантов взаимодействует с молекулярным рецептором, сопряженным с G-белком, сигнал от которого передается на связанную с ним аденилатциклазу. Активированная аденилатциклаза гидролизует АТФ с образованием цАМФ. Повышение его концентрации в цитозоле открывает Са²⁺-каналы, регулируемые цАМФ, в результате чего изменяется проницаемость плазмолеммы рецепторных клеток и происходит ее деполяризация – генерируется рецепторный потенциал.

В обонятельных клетках, чувствительных к цинеолу, активируется, по-видимому, рецепторная тирозинкиназа, сопряженная с аденилатциклазой, вследствие чего синтезируется цАМФ, и им в плазматической мембране открываются Са²⁺-каналы, приводя в конечном итоге к генерации рецепторного потенциала.

В обонятельных клетках, взаимодействующих с камфорой, стимулируется, вероятно, рецепторная тирозинкиназа, с которой сигнал передается на фосфолипазу С, а она гидролизует фосфоинозитиды с образованием 1,4,5-трифосфоинозитида, взаимодействующего со своим рецептором на Са²⁺-канале, открывая его для входа кальция из внеклеточной среды в цитозоль. Вследствие этого изменяется проницаемость плазмолеммы и происходит генерация рецепторного потенциала.

Ванилин взаимодействует с рецептором обонятельных клеток, сопряженным с G-белком, который активирует фосфолипазу С, синтезирующую IP₃, приводя, в конце концов, к генерации рецепторного потенциала.

Как видно, в восприятии обонятельными клетками амилового спирта, амилацетата и цинеола участвует система цАМФ. Несмотря на одинаковый посредник, участвующий в рецепции этих веществ, передача сигнала от рецептора на аденилатциклазу оказалась сходной только у амилового спирта, имеющего прогорклый запах, и амилацетата, обладающего фруктовым ароматом. Оба они активируют аденилатциклазу, сопряженную с G-белком. Однако, различными у них могут быть молекулярные рецепторы, взаимодействующие с одорантами, как, например, у гексанола и гептанола, отличющихся друг от друга на один атом углерода (Floriano et al., 2000).

На рис. видно, что в механизме обонятельной трансдукции камфоры и цинеола участвуют не один, а два сигнальных пути передачи информации – сначала активируется тирозинкиназа, а затем один из двух путей: фосфоинозитидный – для камфоры и аденилатциклазный – для цинеола.

В целом у всех одорантов, имеющих фруктовый, прогорклый, цветочный, камфорный или эвкалиптовый запахи, есть общее свойство. В механизм их обонятельной трансдукции вовлекаются внутриклеточные сигнальные системы. При этом сами посредники и механизм их активации у веществ, обладающих качественно разными запахами, различны.