Глава 3. Результаты исследований

3.1. Исследование компонентов внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции различных одорантов

Участие внутриклеточных сигнальных систем в обонянии мы изучали методом флуоресцентного анализа кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток с применением фармакологического анализа. Все необходимые для этого агенты готовили на растворе ХТЦ и вводили в проток для воздействия на выстилку.

Стимуляцию препарата осуществляли таким образом, чтобы воздушная струя, содержащая одорант, была направлена в ту область ольфакторного эпителия, с которой регистрировали флуоресцентный сигнал.

В ходе проведения экспериментов оказалось, что реакцию на тестируемый одорант можно было выявить не в любой области поверхности обонятельной выстилки. Поэтому, обнаружив зону, «чувствительную» к данному пахучему веществу, все дальнейшие манипуляции проводили, не сдвигая препарат с этого участка.

3.1.1. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции амилового спирта

Воздействие на обонятельную выстилку амиловым спиртом, обладающим прогорклым запахом, в 31 опыте приводило к усилению интенсивности флуоресценции на 20 – 45 отн. ед. (рис. 6 а). Продолжительность ответа зависела от его амплитуды и достигала 10 – 30 с, доходя до максимального значения за 3 – 5 с. Следовательно, под действием амилового спирта кальций-аккумулирующая способность клеточных мембран обонятельных клеток увеличивалась.

При обдувании обонятельной выстилки этим одорантом регистрировалась негативная волна электоольфактограммы, которая достигала максимума через 3 – 5 с и длилась около 10 с (рис. 6 б). Как видно, временные характеристики флуоресцентного и электрического сигналов совпадают, а это может, вероятно, свидетельствовать о том, что динамика флуоресенции, как и электроольфактограмма, отображает рецепторные процессы в обонятельных клетках.

Стимуляция препарата на фоне 2 мМ ЭГТА во всех опытах подавляла увеличение флуоресцентного сигнала (рис. 7). Известно, что ЭГТА связывает внеклеточный кальций. Следовательно, реакция на амиловый спирт исчезала в бескальциевой среде. Это, в свою очередь, означает, что для ее обеспечения необходим Са²⁺ в интерстиции.

Роль внутриклеточных Са²⁺-депо в реакции обонятельных кеток на амиловый спирт мы исследовали в 15 опытах посредством кофеина, который в концентрации 10 мМ опустошает внутриклеточные кальциевые хранилища, обеспечивая депо-зависимый вход Са²⁺ в цитозоль. Как видно на рис. 7, действие его на обонятельную выстилку не вызывало усиления флуоресценции, подобное амиловому спирту. Это означает, что повышение кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток под действием амилового спирта не обусловливается усилением проницаемости для Са²⁺, вызванным истощением его запасов в эндоплазматическом ретикулуме.

На рис. 9 представлены данные, полученные при действии на обонятельную выстилку 100 мкМ кофеином (n=15), который в этой концентрации ингибирует фосфодиэстеразу, повышая тем самым внутриклеточное содержание цАМФ. Как видно, под его влиянием интенсивность флуоресценции препарта в зоне стимуляции не меняла своего значения. Следовательно, увеличение содержания цАМФ в цитозоле при выключении фосфодиэстеразы не влияло на кальций-аккумулирующую способность мембран исследуемых клеток подобно тому, как это делал амиловый спирт. Следовательно, увеличение флуоресцентного сигнала при стимуляции одорантом не индуцировалось повышением цитозольной концентрации циклонуклеотида, за счет ингибирования фосфодиэстеразы. Однако амплитуда сигнала и его длительность под действием амилового спирта на фоне кофеина увеличивались (рис.10). Вероятно, ФДЭ, снижая концентрацию цАМФ в цитозоле, участвует в регуляции ответа на одорант.

Роль активации аденилатциклазы в реакции рецепторных клеток на амловый спирт мы исследовали с помощью форсколина, специфически активирующего этот фермент. Данные предсталены на рис. 11, на котором видно, что аппликация форсколина (10 мкМ) на обонятельную выстилку усиливала световой сигнал, имитируя действие одоранта. Очевидно, этот эффект обусловлен активацией форсколином аденилатциклазы, гидролизующей АТФ с образованием цАМФ в обонятельных клетках. По-видимому, амиловый спирт увеличивал кальций-аккумулируюшую способность мембран обонятельных клеток по механизму, сходному с действием форсколина, то есть в результате активации аденилатциклазы.

Подтверждением этого вывода стала стимуляция обонятельной выстилки амиловым спиртом на фоне специфического ингибитора аденилатциклазы 2,5-дидеоксиаденозина. Во всех опытах выключение активности этого фермента полностью подавляло одорант-индуцируемое увеличение флуоресценции (рис. 12).

Чтобы определить участие G-белка в реакции на амиловый спирт, на обонятельную выстилку апплицировали AlF₄^-. Для этого на препарат сначала воздействовали фтористым натрием, а затем хлористым алюминием. Известно, что форалюминат активирует ГТФ-связывающий белок, минуя рецептор. На рис. 13 видно, что под его действием (n=7) флуоресцентный сигнал был сходен с тем, который регистрировали при стимуляции препарата амиловым спиртом. Сходство реакций под действием одоранта и фторалюмината свидетельствует о тождестве механизмов их действия на обонятельные клетки. Следовательно, кальций-аккумулирующая способность клеточных мембран изменяется в результате активации G-белка, происходящей под действием амилового спирта.

Вторым важным ферментов в аденилатциклазном пути трансдукции является ПКА. Ее участие в реакции на амиловый спирт мы изучали с помощью Н-7 в концентрации 50 мкМ, который является ингибитором этого фермента. Как показали результаты опытов, стимуляция препарата амиловым спиртом в присутствии в среде Н-7 (n=7) приводила к такому же усилению интенсивности флуоресценции, как и без него (рис.14). Это означает, что изменение кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток под действием исследуемого одоранта не зависит от функционирования протеинкиназы А.

Мы показали, что основная роль в трансдукции амилового спирта в обонятельных клетках принадлежит внутриклеточной сигнальной системе цАМФ. Логично было предположить, что вход ионов кальция из внеклточной среды в цитозоль осуществляется через каналы, регулируемые циклическим адениозинмонофосфатом. Для проверки этого предположения мы использовали нефидипин (10 мкМ), который является ингибитором циклонуклеотид-зависимых кальциевых каналов в обонятельных клетках.

При обдувании обонятельной выстилки амиловым спиртом на его фоне во всех 7 опытах реакции на стимул не было (рис.15). Во-первых, это свидетельствует о том, что для увеличения кальций-аккумулирующей способности мембран ольфакторных клеток под действием одоранта требуется изменение проницаемости плазмолеммы для входа ионов кальция, а во-вторых, эта проницаемость регулируется циклическими нуклеотидами.

Характерной особенностью Са²⁺-каналов, управляемых цАМФ, является их способность к ингибированию при повышении концентрации ионов кальция как в интерстиции, так и в цитозоле. Для исследования влияния цитозольного кальция на циклонуклеотидзависимые каналы мы инкубировали обонятельную выстилку (n=5) в кальциевом ионофоре иономицине (1 мкМ), а для изучения воздействия на эти каналы ионов кальция из инерстиция повышали внем их содержание путем введения в бескальциевую среду 2 мМ СаCl₂ (n=8). Оказалось, что на фоне как иономицина, так и хлорида кальция стимуляция препарата амиловым спиртом не приводила к усилению Са²⁺-сигнала (рис.16, 17). Следовательно, кальций-аккумулирующая способность мембран обонятельных клеток увеличивается под действием амилового спирта в результате открывания циклонуклеотид-зависимых Са²⁺-каналов.

Иономицин используют также для доказательства участия в реакциях на стимулы фосфоинозитидной сигнальной системы (Авдонин, Ткачук, 1994). Известно, что повышение концентрации кальция в цитозоле активирует протеикиназу С, принадлежащую фосфоинозитидному пути трансдукции. В таком случае действие этого агента вызывает реакцию, сходную с исследуемой. На рис.18 видно, что под влиянием иономицина реакция обонятельной выстилки не регистрировалась. Значит, в обонятельных клетках, чувствительных к амиловому спирту, в реакцию не вовлекаются фосфоинозитиды. Таким образом, участие системы цАМФ в рецепции амилового спирта было нами подтверждено не только прямыми доказательствами, но и методом исключения.

Итак, под действием амилового спирта в обонятельных клетках активируется сигнальная система цАМФ, связанная с активацией аденилатциклазы, сопряженной с G-белком.