2.4. Электроольфактография

Флуориметрические показатели обонятельной рецепции, применяемые впервые в нашей работе, мы сопоставляли с электрофизиологическими параметрами реакций обонятельных рецепторов на одоранты. Для этого мы регистрировали электроольфактограмму (ЭОГ). ЭОГ представляет собой сложный сигнал от обонятельных клеток in situ, происходящий в результате медленных колебаний потенциала между поверхностью обонятельной выстилки и подлежащей тканью, которые регистрируются электродом, помещенном на поверхности обонятельного эпителия. Негативная волна ЭОГ – это рецепторный потенциал, который отражает суммарный ответ деполяризованных обонятельных клеток (Минор, Бызов, 1977; Минор, Васильева, 1980). С помощью ЭОГ

регистрируется электрическая активность и нерецепторных элементов, но их вклад незначителен, и им можно пренебречь (Минор, 1980; Frings et al., 1991; Scott, Brierly, 1999; Scott et al., 2000; Scott-Jhonson et al., 2000; Takeuchi, Kurahashi, 2003). Следовательно, ЭОГ адекватно отображает процессы обонятельной рецепции.

Схема установки для регистрации электоольфактограммы представлена на рис. 4. Для отведения ЭОГ изолированную обонятельную выстилку помещали на покровное стекло в каплю раствора Рингера, покрывающего ее тонким слоем. Сигнал отводили стеклянными электродами, один из которых размещали на поверхности препарата, а другой – под ним. Электроды заполняли 3М раствором хлористого калия. После усиления и преобразования сигнал регистрировали на персональном компьютере и обрабатывали посредством компьютерных программ.

2.5. Методика стимуляции обонятельной выстилки

В качестве одоранта с прогорклым запахом мы использовали амиловый спирт – одноатомный предельный алифатический спирт. Фруктовый аромат получали от амилацетата, который является амиловым эфиром уксусной кислоты.

Камфорный запах принадлежал в наших опытах природной тертой d-камфоре, а аромат душистого эвкалипта – цинеолу. Оба эти вещества являются представителями терпеновых углеводородов. Терпены – самая большая группа вторичных продуктов, содержащихся в высших растениях, смоле хвойных деревьев, в соке каучуковых. Камфора и цинеол являются монотерпенами. Это самые простые представители терпенов. Терпеновые группировки входят в структуру таких витаминов, как Д, Е, К, А.

Одорантом с запахом цветов был ванилин.

Аммиак, источником которого в наших опытах был нашатырный спирт (10%), и сероводород, выделяющийся из меркаптоэтанола, применялись соответственно в качестве острого и гнилостного запахов.

Для проведения экспериментов были подобраны адекватные концентрации исследуемых одорантов. Чем меньше концентрация применяемого пахучего вещества, тем меньшее число обонятельных клеток на него реагирует (Dubin, Dione, 1993), а интенсивность флуоресценции тем выше, чем больше клеток светится. Одной из проблем является трудность контроля за временем действия стимула и его интенсивности. Это связано с тем, что назальный эпителий покрыт слоем слизи, через который молекулы одорантов должны диффундировать к активным центрам молекулярных рецепторов. Показано, что ни латентный период, ни скорость достижения максимального ответа, ни полувремя до этого пика, ни степень распознавания одоранта не зависели от концентрации стимула (вплоть до насыщающей концентрации) (Duchump-Viret et al., 2000; Firestein et al., 1990; Dubin, Dionne, 1993).

По данным S. Firestein and F. Werblin (1989), полученным на изолированных обонятельных клетках и тонкослойных препаратах обонятельного эпителия саламандры, ольфакторные рецепторы имеют высокие пороги восприятия. Известно, что пороговые величины одного и того же вещества могут оказаться различными в зависимости от метода регистрации. Порог является вероятностной характеристикой. О его достижении судят по проценту правильных ответов, что приводит к большому разбросу результатов.

Концентрации раздражителей в наших опытах мы подбирали по изменению двигательной активности обонятельных жгутиков, которая считается показателем функционального состояния препарата, и оценивали посредством прижизненной телевизионной микроскопии. Для всех одорантов наиболее адекватной оказалась концентрация в 1 мМ. Чтобы обеспечить стимуляцию, ватный тампон смачивали пахучим веществом и помещали в наконечник дозатора с диаметром кончика 700 мкм и емкостью в 1мл. Для каждого пахучего вещества применялся свой одноразовый съемный наконечник, что позволило нам уйти от проблемы, связанной с отмыванием стимулирующего устройства от предыдущего запаха. Обонятельную выстилку раздражали парами пахучих веществ со скоростью 2,5 мл в секунду в течение 3 – 4 секунд на расстоянии 0,5 см от поверхности препарата. Воздушная струя направлялась в ту область обонятельной выстилки, с которой регистрировался люминесцентный сигнал. Необходимо отметить, что на предъявляемый раздражитель реагировала не вся поверхность выстилки, а определенные ее участки, чувствительные к данному запаху (разные для разных одорантов). В связи с этим зона, в которой обнаруживалась реакция на одорант, не менялась в процессе эксперимента.