- •Глава 1. Обзор литературы (клеточно-молекулярные основы обонятельной трансдукции)
- •Строение органа обоняния
- •1.2. Строение обонятельных клеток
- •Механизмы обонятельной трансдукции
- •Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов
- •1.3.2. Роль внутриклеточной сигнальной системы цАмф в рецепции одорантов
- •1.3.2.1. Роль аденилатциклазы в обонятельной рецепции
- •1.3.3. Участие Golf-белка в рецепции одорантов
- •1.3.5. Участие фосфоинозитидного пути передачи сигнала в обонятельных клетках
- •1.3.5.1. Роль фосфолипазы с в обонятельной трансдукции
- •1.3.5.2. Участие протеинкиназы с в обонятельной трансдукции
- •Роль тирозинкиназной сигнальной системы в обонятельной рецепции
- •1.4. Двигательная активность обонятельных жгутиков
- •1.5. Влияние одорантов на митохондриальное дыхание обонятельных клеток
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1. Объект исследования
- •2.2. Методы люминесцентной микроскопии
- •2.2.1.Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках
- •2.2.2. Флуоресцентный анализ клеточного дыхания обонятельных клеток
- •2.2.3. Конфокальная сканирующая иммунофлуоресцентная микроскопия
- •2.3. Метод прижизненной телевизионной микроскопии
- •2.4. Электроольфактография
- •2.5. Методика стимуляции обонятельной выстилки
- •2.6. Фармакологический анализ
- •Глава 3. Результаты исследований
- •3.1. Исследование компонентов внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции различных одорантов
- •3.1.1. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции амилового спирта
- •3.1.2. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции камфоры
- •3.1.3. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции цинеола
- •3.1.4. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилацетата
- •3.1.5. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции ванилина
- •3.1.6. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции аммиака
- •3.1.7. Исследование участия внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток в рецепции сероводорода
- •3.2. Исследование влияния одорантов на митохондриальное дыханине обонятельных клеток
- •3.2.1. Исследование влияния амилового спирта на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.2. Исследование влияния камфоры на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.3. Исследование влияния цинеола на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.4. Исследование влияния амилацетата на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.5. Исследование влияния ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.6. Исследование влияния аммиака на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.7. Исследование влияния сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.3. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •3.3.1. Энергетическое обеспечение двигательной активности обонятельных жгутиков
- •3.3.2. Роль цитоскелета в движениях обонятельных жгутиков
- •Глава 4. Обсуждение результатов
- •4.1. Исследование внутриклеточных сигнальнх систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина
- •4.2. Исследование механизмов обонятельной трансдукции аммиака и сероводорода
- •4.3. Исследование влияния аммиака и сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий
- •4.4. Исследование влияния амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •4.5. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •Заключение
- •Список литературы
2.2.3. Конфокальная сканирующая иммунофлуоресцентная микроскопия
Полимеризованный F-актин определяли посредством конфокальной сканирующей иммунофлуоресцентной микроскопии. Для этого обонятельную выстилку резали на тонкие пласты и помещали на силиконизированные покровные стекла, покрытые фибронектином, и культивировали в течение 1 ч. Затем препарат фиксировали 3% раствором формалина на растворе Рингера 10 мин, пермеабилизовывали 0,1% раствором тритона Х-100 на растворе Рингера 15 минут. Обонятельную выстилку промывали 3 раза раствором Рингера и инкубировали с моноклональными антителами к р65 и вторыми антителами, конъюгированными с TRITC, полученными против иммуноглобулинов мыши. Все инкубации с антителами проводили 30 минут и клетки трижды промывали раствором Рингера после каждой инкубации.
Разрушали полимеризованный F-актин с помощью цитохалазина. Для этого через час после культивирования обонятельной выстилки на силиконизированных покровных стеклах меняли среду на другую, содержащую 100 нгмл-1 эпидермального фактора роста и 2 мкгмл-2 цитохалазина и повторяли описанную выше процедуру.
Препараты исследовали с помощью конфокального микроскопа Leica (ФРГ). Для возбуждения флуоресценции использовали HeNe лазер с длиной волны 543 нм. Применяли сканирование в области флуоресценции на длине волны 580 – 640 нм.
2.3. Метод прижизненной телевизионной микроскопии
Метод прижизненной телевизионной микроскопии позволяет в реальном времени изучать подвижность обонятельных жгутиков (рис. 3). Для этого тонкий срез препарата обонятельной выстилки в капле раствора Рингера (рН 7,33) размещали на предметном столике светового микроскопа МИКМЕД-2 ОАО "«ЛОМО». В качестве источника освещения использовали галогеновую лампу (6В, 25 Вт). В исследованиях использовали объектив 63х/0,8 (воздушная иммерсия), фотонасадку 14х и нейтральный светофильтр.
Изображение объекта регистрировали видеокамерой КРС-300С фирмы КТ и С, которая имеет разрешение по горизонтали 380 телевизионных линий. Минимальная освещенность на препарате составляет 0,1 люкс. Кроме того, в данной видеокамере предусмотрены автоматический баланс белого, позволяющий получать четкое изображение микрообъекта, и функция компенсации засветки, которая повышает верность воспроизведения изображения, особенно в случае, если источник света расположен напротив видеокамеры, что имеет место в данной установке.
Светочувствительным элементом в используемой нами камере служила ПЗС-матрица, состоящая из большого числа светочувствительных ячеек, в которых под воздействием света накапливается отрицательный заряд определенной величины. Этот заряд преобразуется в напряжение, величина которого, в свою очередь, переводится в цифровую форму в аналого-цифровом преобразователе камеры.
Разрешающая способность ПЗС-матрицы определяется количеством составляющих матрицу элементов (пикселей) и ее размером. Используемая видеокамера передает данные в телевизионном стандартном PAL. Поэтому число пикселей, необходимых для фиксации изображения, составляет 415000. Размер ПЗС-матрицы – 20,2 мм2. Следовательно, разрешающая способность данной видеокамеры составляет 7 мкм. Поскольку экран монитора увеличивает изображение в 4 раза, то общее увеличение системы для прижизненной люминесцентной микроскопии составляло 3528 крат. Это позволяло увидеть отдельные обонятельные жгутики на тонких срезах обонятельной выстилки и наблюдать их движение.
Регистрацию цилиарной двигательной активности у обонятельных клеток проводили с помощью описанной цифровой видеокамеры через плату ввода видеоизображения на жесткий диск персонального компьютера с процессором Intel Pentium I. В данной установке использовали плату ввода видеоизображения Studio DC 10 plus фирмы Pinnacle Systems Inc. Эта плата не зависит от телевизионных стандартов и позволяет оцифровать сигнал в стандарте PAL, который был выбран в ходе предварительных исследований, при разрешении 720х540 пикселей и частоте 25 кадров в 1 с. Записанные на жесткий диск компьютера видеоизображения обрабатывали специальной программой Pinaccle Studio 7.0, поставляемой вместе с платой ввода Studio DC 10 plus, и программой Virtual Dub 1.3 c.
Стимуляция препарата в данной методике отличалась от предыдущих. Растворы одорантов подавали в проток под покровное стекло и регистрировали двигательную активность обонятельных жгутиков в ответ на раздражитель.