205

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Обоняние относится к пяти чувствам, которые интересовали человека с незапамятных времен, но успехи в понимании молекулярных механизмов обонятельной рецепции достигнуты в последние годы. Методами биохимического, генетического, иммуноцитохимического анализа идентифицированы рецепторные молекулярные комплексы в обонятельных жгутиках и показано, что они принадлежат большому семейству рецепторов, сопряженных с G-белками (Boyle et al., 1987; Lancet, 1987; Clyne et al., 1999; Dryer, Berghard, 1999).

Выявлены ключевые ферменты путей сигнальной трансдукции – аденилатциклаза и фосфолипаза С (Bakalyar et al., 1990; Menco et al., 1992; Iorgenko, Levin, 2000). Образующиеся при их участии вторичные посредники (соответственно цАМФ и IP3) открывают кальциевые каналы в мембране обонятельных жгутиков (Restrepo et al., 1992; Matsuzaki et al., 1999), что обеспечивает сопряжение между конформационными изменениями рецепторных молекулярных комплексов и электрическими процессами, осуществляющими передачу информации в центральную нервную систему.

Однако достижения в изучении механизмов обонятельной трансдукции, закрыв немало прежних вопросов, поставили еще больше новых. Установлено, что в рецепции одорантов участвует аденилатциклазный путь трансдукции, а в восприятии феромонов – фосфоинозитидный путь. Однако есть данные о том, что последний осуществляет трансдукцию сигналов и в обонятельных клетках, но до сих пор не выяснено, в каких взаимоотношениях находятся эти пути в обеспечении обонятельной рецепции. Нет ответа на вопросы о возможном участии в ней других сигнальных систем, в частности тирозинкиназной, о возможных различиях в вовлечении тех или иных вторичных мессенджеров в трансдукцию сигналов об одорантах, обладающих качественно разными запахами. Не прослежена последовательность включения в обонятельную трансдукцию компонентов сигнальной системы, активируемой данным пахучим веществом.

Если во вкусовой, каротидной и медуллярной рецепции доказано наличие гетерогенных механизмов восприятия качественно разных агентов (Самойлов и др., 1978; Самойлов и др., 1980; Лотарев, Самойлов, 1986, 1987), то исследователи обонятельной системы до сих пор не задумывались о возможной гетерогенности первичных рецепторных процессов при обонянии веществ, обладающих различными запахами.

Нет сведений об энергетическом метаболизме обонятельных клеток, включая обеспечение энергией двигательной активности обонятельных жгутиков, а это тормозит развитие весьма интересных представлений А.А.Бронштейна (1966, 1977) о важной роли цилиарной подвижности в активном поиске одорантов, растворенных в обонятельной слизи. Не установлены различия в изменениях движений жгутиков под действием качественно разных одорантов.

По нашему мнению, изучение механизмов обонятельной рецепции с позиций теории гетерогенности хемосенсорных систем (Самойлов, 1983) может иметь как теоретическое, так и практическое значение для биологии и медицины, животноводства, парфюмерии и бионики. Известна высокая чувствительность, специфичность и широкий диапазон воспринимаемых обонятельными клетками запахов, которые обеспечиваются специфическими механизмами их восприятия. Биофизические механизмы узнавания запахов могут быть основой для создания искусственных обонятельных сенсоров (Минор, Зинкевич, 1997). Предпринимаются попытки использования принципов, лежащих в основе этих специфических для рецепторных клеток свойств, для моделирования сверхчувствительных приборов химического анализа (Ганшин, Зинкевич, 2002).

Изучение механизмов действия, воспроизведение и синтез в промышленных масштабах веществ, обладающих отпугивающими или привлекательными запахами, могут сыграть решающую роль в овладении методами активного управления поведением и регулирования численности полезных или вредных для человека животных.

Важное практическое значение имеет использование одорантов в качестве простого инструмента для воздействия на эмоции человека. В частности, показано (Villemure et al., 2003), что запахи могут вызывать эмоциональные состояния, снижающие восприятие боли.

Знание особенностей строения и работы обонятельных рецепторных клеток необходимо для активного вмешательства при некоторых патологических состояниях органов обоняния.

У животных и человека известны различного рода аносмии. Электрофизиологический анализ мышей со специфической аносмией показал, что дефект обоняния связан с нарушениями в периферическом отделе анализатора и не влияет на механизм центральной обработки (Lancet, 1986; Griff, Reed, 1995). Одной из причин специфической аносмии может быть дефицит циклических нуклеотидов (Winstock et al., 1986). Полагают, что этот феномен является следствием мутации или дефицита гена, кодирующего белок для одного из типов молекулярного обонятельного рецептора (Lancet, 1986).

Вместе с тем известно, что нарушения обоняния у человека вызывают развитие состояния тревожности, стойкие депрессивно-подобные изменения поведения вплоть до депрессий, которые вызываются не только повышенной тревожностью, но и отсутствием положительных эмоций, получаемых от сенсорной стимуляции (Макарчук, Калуев, 2000). Показано также (Bello, Rummler, 1980), что при сенсорном обонятельном дефиците возникает гипокликемия.

В настоящее время предпринимаются попытки помочь пациентам с такой патологией. Известно, что люди со специфической аносмией способны приобретать долгосрочную периферическую чувствительность к данному пахучему веществу после повторного длительного воздействия его высоких концентраций. Реакция стабильна и держится до 6 недель. Полагают, что появление чувствительности связано со стимул-зависимой активацией экспрессии специфического рецептора. Длительное воздействие стимула приводит к повышению уровней вторичных посредников, которые могут положительно регулировать генную экспрессию для одного или более компонентов сигнального пути (Griff, Reed, 1995).

Целью диссертационной работы являлось изучение различий в механизмах обонятельной трансдукции сигналов об одорантах, обладающих разными запахами.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) с использованием флуориметрического и фармакологического анализов определить участие аденилатциклазного, фосфоинозитидного и тирозинкиназного путей в обонятельной трансдукции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата, ванилина, аммиака и сероводорода;

2) исследовать компоненты сигнальных систем, участвующих в рецепции каждого из перечисленных одорантов;

3. изучить влияние пахучих стимулов на активность дыхательной цепи митохондрий рецепторных клеток;

4. выявить характер изменений двигательной активности обонятельных жгутиков при действии одорантов и исследовать роль актинового компонента цитоскелета в этом процессе.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Обонятельная рецепция обеспечивается гетерогенными механизмами трансдукции. Гетерогенность обонятельной рецепции проявляется в следующих феноменах: - в рецепторные процессы, обеспечивающие восприятие веществ, обладающих разными запахами, вовлекаются различные сигнальные системы;

- если в рецепцию одорантов включаются одинаковые пути трансдукции, то компоненты этих путей различны;

- в обонятельной рецепции одорантов, имеющих острый и гнилостный запахи, внутриклеточные сигнальные системы не участвуют;

- действие на митохондриальное дыхание качественно разных одорантов принципиально различно;

- качественно разные одоранты по-разному изменяют двигательную активность обонятельных жгутиков.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Благодаря проведению комплексного исследования механизмов обонятельной трансдукции, клеточного метаболизма, двигательной активности обонятельных жгутиков, роли цитоскелета и электрофизиологических реакций в рецепторных клетках обонятельной выстилки лягушки при стимуляции одорантами, имеющими разные запахи, впервые выявлены гетерогенные механизмы обонятельной рецепции.

Гетерогенность проявляется в том, что в рецепторные процессы, обеспечивающие восприятие веществ, обладающих разными запахами, вовлекаются различные сигнальные системы: в рецепцию веществ, обладающих прогорклым, эвкалиптовым и фруктовым запахами, - цАМФ, а в рецепцию одорантов с камфорным и цветочным запахами – 1,4,5-трифосфоинозитиды. При этом у веществ, входящих в одну группу химических соединений, в механизме трансдукции участвуют различные сигнальные системы обонятельных клеток.

Впервые показано, что гетерогенность обонятельной трансдукции проявляется и в том, что при участии в рецепции разных одорантов одной и той же сигнальной системы ее компоненты могут быть различными. Так, под действием ванилина и камфоры в обонятельных клетках стимулируется гидролиз фосфоинозитидов. Однако в восприятии ванилина участвует Golf-белок, а камфоры нет.

Впервые выявлено, что для восприятия веществ с камфорным и эвкалиптовым запахами необходимо участие тирозинкиназы, передающей сигнал далее на эффекторные белки: фосфолипазу С для камфоры и аденилатциклазу – для цинеола.

В обонятельную рецепцию одорантов, имеющих острый и гнилостный запахи, внутриклеточные сигнальные системы не вовлекаются. Эти одоранты действуют непосредственно на митохондрии.

Впервые гетерогенность обонятельной рецепции обнаружена в принципиальных различиях действия ни активность дыхательной цепи митохондрий одорантов, обладающих разными запахами. Пахучие вещества, обладающие прогорклым, камфорным, эвкалиптовым, фруктовым и цветочным запахами активируют митохондриальное дыхание, но такая активация связана с повышением содержания кальция в цитозоле обонятельных клеток, что, в свою очередь, обусловлено влиянием одорантов на внутриклеточные сигнальные системы: амилового спирта, амилацетата и цинеола- на цАМФ (через аденилатциклазу), камфоры и ванилина – на IP3 (через фосфолипазу С). Одоранты, имеющие острый и гнилостный запахи, оказывают непосредственное действие на окислительный метаболизм обонятельных клеток. При этом аммиак ингибирует транспорт электронов по дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток с флавопротеидов на убихинон, тогда как сероводород - на всем ее протяжении.

Гетерогенность выявлена и при исследовании изменений двигательной активности обонятельных жгутиков. Показано, что амиловый спирт, камфора, цинеол, амилацетат, ванилин и аммиак инициировали цилиарные движения, тогда как сероводород их останавливал. Поскольку в рецепцию этих одорантов вовлекаются различные сигнальные системы, то и механизмы, участвующие в изменении характера жгутиковой активности, тоже разные, что является еще одним аргументом в пользу неоднородных физических и химических процессов, лежащих в основе биомеханических процессов жгутикового аппарата обонятельных клеток. Это относится и к формированию в них актинового цитоскелета, обеспечивающего им активные движения при стимуляции одорантами, что впервые было нами показано.

Таким образом, в диссертационной работе впервые показано, что разнородная рецепция пахучих веществ является сложным процессом, который включает механизм обонятельной трансдукции, сопряженный с активацией дыхательной цепи митохондрий и биомеханическими преобразованиями жгутикового аппарата обонятельных клеток. При этом рецепция одорантов, обладающих качественно разными запахами, обеспечивается посредством неоднородных физических и химических процессов. Следовательно, не только вкусовой, каротидной, медуллярной, но и обонятельной рецепции присуща гетерогенность механизмов трансдукции.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Теоретическая значение проведенной работы заключается в том, что выявленная гетерогенность обонятельной рецепции существенно дополнила концепцию гетерогенности хеморецепции, распространив ее на все хемосенсорные системы. Выявление биофизических, биохимических и физиологических механизмов внутриклеточной сигнализации в обонятельных рецепторах имеет важное значение для понимания процессов, осуществляющих восприятие внешнего сигнала и передачу информации о нем в центральную нервную систему.

Самостоятельное теоретическое значение имеют полученные в работе данные о реорганизации актинового цитоскелета в процессе восприятия обонятельного стимула, что расширило представление о роли движений обонятельных жгутиков в активном поиске пахучих веществ, растворенных в обонятельной слизи.

Полученные в работе новые данные о неоднородности физических и химических механизмов обонятельной рецепции имеют не только теоретическое, но и практическое значение для медицины, парфюмерии, сельского хозяйства и экологии. Знание особенностей строения и работы обонятельных рецепторных клеток необходимо для активного вмешательства при некоторых патологических состояниях, в частности, при аносмиях.

Изучение механизмов действия, а также синтез в промышленных масштабах веществ, обладающих отпугивающими или привлекательными запахами, могут играть решающую роль в овладении методами активного управления поведением и регулирования численности полезных или вредных для человека животных.

Понимание механизмов обонятельной рецепции важно для бионики. Биофизические механизмы узнавания запахов могут быть основой для создания искусственных обонятельных сенсоров при конструировании сверхчувствительных приборов химического анализа.

Результаты могут быть использованы при чтении курса лекций по физиологии сенсорных систем, биофизике сенсорных систем, а также внутриклеточным сигнальным системам.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию Красноярского легочно-аллергологического центра (Красноярск, 1997); VII национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1997); Всероссийской научно-практической конференции « Проблемы терапевтической и хирургической пульмонологии» (20 – 22 октября, 1997; Санкт-Петербург, 1997); Международном симпозиуме, посвященном 150-летию И.П.Павлова «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Перебург, 1999); X международном симпозиуме «Экологические проблемы адаптации» (Москва, 29 – 31 января 2001); Международной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 75-летию со дня рождения А.М.Уголева (Санкт-Петербург, 14 – 16 марта, 2001); IV Международной конференции по фундаментальной нейроморфологии. Колосовские чтения 2002 (Санкт-Петербург, 2002); XVII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001); Всероссийской Конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (доклад на тему: «Гетерогенность биофизических механизмов» (Пущино, 11 - 14 ноября, 2002)); научно-практической конференции, посвященной 40-летию больницы РАН (Санкт-Петербург, 25 декабря, 2002); IV Всесоюзной конференции по проблемам науки и высшей школы «Фундаментальные исследования в технических университетах» (Санкт-Петербург, 6 – 7 июня, 2002); XI Международном симпозиуме «Экологические проблемы адаптации» (Москва, 2003); Научной конференции по итогам работы в 2003 г. в рамках программы «Фундаментальная наука – медицине» (10 – 11 декабря. Москва, 2003); III съезде биофизиков России (24 – 29 июня 2004). Воронеж, 2004; Международной конференции «Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине» (к 100-летнему юбилею присуждения Нобелевской премии академику И.П.Павлову) (15 – 16 июня 2004). Минск, Республика Беларусь. 2004; Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнические ситемы в XXI веке» Санкт-Петербург. 2004.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Глава 1. Обзор литературы (клеточно-молекулярные основы обонятельной трансдукции)

1. Строение органа обоняния

Орган обоняния представляет собой периферический отдел обонятельной сенсороной системы. У бесхвостых амфибий он образован двумя мешками, расположенными на дорсальной поверхности головы и разделеными перегородкой. На дне главной носовой полости в виде возвышения располагается обонятельный бугорок. Основным структурным элементом органа обоняния позвоночных является многорядный ольфакторный эпителий, который покрывает сплошным пластом бугорок, медиальный край и крышу главной носовой полости. Толщина его у разных представителей земноводных различна и варьирует в разных участках обонятельной выстилки. В среднем у лягушек она составляет 80 – 150 мкм (Бронштейн, 1977).

У всех позвоночных обонятельный эпителий имеет в своем составе клетки трех типов – рецепторные, опорные и базальные. Общее количество рецепторных клеток у бесхвостых амфибий колеблется в пределах от 470000 у краснобрюхой жерлянки до 2650000 у озерной лягушки. Плотность расположения их в ольфакторном эпителии составляет у лягушек семейства Ranidae – 98000 – 100000 на 1мм² (Бронштейн, 1977). Таким образом, у таких наземных видов, как травяная и остромордая лягушки, обонятельная система довольно хорошо развита.

Обонятельные клетки являются первичночувствующими (нейросенсорными) рецепторами. Тела их имеют веретенообразную форму с поперечным диаметром 5 – 8 мкм. От апикального полюса биполярной обонятельной клетки отходит периферический отросток длиной 20 – 90 мкм и диаметром 0,8 – 4,0 мкм. Он простирается до апикальной поверхности ольфакторного эпителия. От базального полюса начинается тонкий аксон толщиной 0.1 – 0.3 мкм, который, не разветвляясь, тянется в обонятельную луковицу переднего мозга, образуя обонятельный нерв, непосредственно связывающий рецепторные клетки с первичными обонятельными центрами.

Рецепторные клетки перемежаются с опорными, имеющими форму удлиненной рюмки. Между вершиной каждого периферического отростка и мембранами соседних опорных клеток образуются плотные контакты в виде пояса, отделяющего булаву от остальной части отростка. Благодаря этому создан диффузионный барьер между наружной средой и внутренним межклеточным пространством. Между рецепторными, опорными и рецепторными клетками обонятельного эпителия мышей и амфибий методами in situ гибридизации и иммуногистохимии обнаружены щелевые контакты, которые призваны играть фундаментальную роль в переработке информации в обонятельном эпителии (Zhang et al., 2000). По мнению автора, в обонятельных клетках они вовлекаются в координирующую функцию и передачу ионов и метаболитов в момент роста, дифференцировки клеток и переработки сигнала. С их участием открывание всего одного ионного канала может вызвать генерацию потенциала действия.

Щелевые контакты между опорными клетками участвуют в поддержании ионного состава интерстициальной жидкости, которая омывает их и рецепторные клетки, а также обеспечивают удаление избыточных внеклеточных ионов калия в период высокой активности обонятельных клеток (Zhang et al., 2000).

Опорные клетки обонятельного эпителия земноводных полностью утрачивают реснички и снабжены микровиллами длиной от 1,5 мкм до 3 мкм на апикальной поверхности. Большинство этих клеток содержит крупные секреторные гранулы, которые выделяются в просвет обонятельной полости и участвуют в образовании обонятельной слизи. Опорные клетки являются не только поддерживающим аппаратом, но выполняют трофическую и секреторную функции, а также участвуют в удалении из обонятельного эпителия дегенерировавших обонятельных клеток (Попова, 1966; Бронштейн, 1977). Таким образом, опорные клетки полифункциональны.

Под ними располагаются базальные клетки. Они имеют неправильную кубовидную или конусовидную форму, не достигают поверхности обонятельного эпителия, а распластываются над базальной мембраной, которая отделяет обонятельный эпителий от подлежащей соединительной ткани. Делящиеся недифференцированные базальные клетки заменяют отмирающие старые рецепторные, срок жизни которых измеряется 5 – 8 неделями. Возникают незрелые обонятельные клетки, конечное созревание которых наступит только тогда, когда аксон сформирует синапс на обонятельной луковице, а периферический отросток достигнет апикальной поверхности ольфакторного эпителия и образует обонятельные жгутики (Cunningham et al., 1999).

У всех наземных позвоночных в соединительнотканном слое располагаются Боуменовы железы, выводные протоки которых пронизывают ольфакторный эпителий. Благодаря им на поверхность обонятельной выстилки выделяется белково-полисахаридный секрет, участвующий в формировании слоя обонятельной слизи.

Слизь ведет себя как структурированный матрикс и играет роль фактора, определяющего интенсивность, крутизну нарастания и в некоторой степени качества запаха. Слизь представляет собой сложный многокомпонентный раствор биополимеров, способных связывать пахучие молекулы, и обладает высокой степенью упорядоченности своей структуры, образуя над поверхностью эпителия два слоя. Один из них, глубокий образуется секретом опорных клеток. Он более жидкий, в него погружены обонятельные булавы, проксимальные отделы жгутиков и микровиллы опорных клеток. Второй, поверхностный, состоит из более вязкого секрета Боуменовых желез, и в нем находятся дистальные отделы обонятельных жгутиков. Толщина обонятельной слизи у лягушек составляет от 7 до 30 мкм, а у крыс – около 5 мкм (Menco, Fаrbman, 1992; Tegoni et al., 2000).

Слизь представляет собой обогащенную одновалентными ионами полиферментную систему, в состав которой входят белки, гидролитические ферменты, кислые и нейтральные мукополисахариды и гликопротеиды, (Попова, 1966; Королев, Фролов, 1977; Семина, 1977; Menco, Farbman, 1992; Новоселов и др., 1995). В составе обонятельной слизи были обнаружены гранулы, содержащие низкомолекулярное вещество (Фесенко, Фесенко, 1977; Фесенко, 1980; Гладышева и др., 1982). Это одорант-связывающие белки. Они принадлежат одному из наиболее богатых классов протеинов, обнаруженных в ольфакторном аппарате. Одорант-связывающие белки – это подкласс липокалинов, способных обратимо связываться с летучими химическими веществами (Tegoni et al., 2000).

У насекомых обнаружены феромон-связывающие (Vogt, Riddiford, 1981) и одорант-связывающие белки (Steinbrecht et al., 1995). Эти белки никогда не сосуществуют в одной и той же сенсилле (Pelosi, Vaida, 1995; Steinbrecht et al., 1996). Пологают (Vogt, Riddiford, 1986; Van der Berg, Zeigelberger, 1991), что основная функция одорант-связывающих белков у насекомых заключается в транспорте пахучей молекулы к обонятельным рецепторам.

Ионный состав обонятельного секрета отличается высоким содержанием ионов натрия и калия (Бронштейн и др., 1973; Бронштейн, 1977). Таким образом, слизь может поддерживать необходимую для функционирования обонятельных клеток концентрацию ионов.

В составе обонятельной слизи обнаружена высокая активность щелочной фосфатазы (Щекочихина, 1966; Гладышева и др., 1980, а, б; Гладышева и др., 1982; Соколов и др., 1987; Ганшин, Зинкевич, 2002). Как известно, этот фермент участвует в процессах внутри- и межклеточного транспорта, обеспечивая высокую проницаемость для различных метаболитов (Гладышева и др., 1982). Большое разнообразие состава слизи обеспечивает широкий набор констант связывания при взаимодействии молекул пахучего вещества с активными центрами макромолекул слизи (Королев, Фролов, 1977). Таким образом, слизевой секрет играет активную роль в периферических процессах обонятельной рецепции.

По мнению О.С.Гладышевой и соавторов (1982), обонятельная слизь выполняет важные функции. Во-первых, она является химической и физической защитой плазматических мембран клеток ольфакторного эпителия от внешних повреждающих воздействий. Наличие слизи создает условия, определяющие жесткость жгутиков и микровилл. Такие свойства слизи, как вязкость, эластичность и проницаемость, определяются содержанием в ней гликопротеинов. Они же способны экранировать поверхность эпителия от некоторых молекул, придавая процессам переноса веществ через него селективный характер. Поверхностно заряженные молекулы гликопротеинов могут обеспечивать векторность процессов транспорта веществ через слизь.

В соединительнотканном слое слизистой носа проходят веточки безмякотного обонятельного нерва, а также мякотные и безмякотные волокна тройничного нерва. В составе этого нерва в обонятельную выстилку носа проникают волокна вегетативной нервной системы, оканчивающиеся на кровеносных сосудах, Боуменовых железах и в основном веществе соединительной ткани (Бронштейн, 1977).

Обонятельный эпителий у большинства позвоночных имеет не бледно-розовую окраску, как респираторный, а желтоватую или желтовато-коричневую, обусловленную пигментом, природа которого и значение пока до конца не выяснены.