1.2.2. Методы выделения и очистки ферментов

Методы дезинтеграции клеток

Выделение и очистка ферментов пожалуй самый сложный процесс в энзимологии, требующий знаний особенности выделяемого фермента и его источника, культуры проведения тонких анализов. Каждый отдельный фермент требует к себе особого внимания и подхода. Большинство ферментов выделяют при низких температурах во избежание инактивации. Существуют много способов выделения ферментов как в лабораторных условиях, так и в промышленности. Мы с вами рассмотрим основные способы: дезинтеграция, экстракция, осаждение (высаливание), хроматография, электрофорез.

Дезинтеграция клеток. Мы с вами уже разобрали, что в зависимости от локализации по отношению к клеточной мембране фермента бывают внеклеточные (экзоферменты), внутриклеточные (эндоферменты) и мембранные или клеточносвязанные. Если мы получили (вырастили) суспензию клеток или культуральную жидкость, ферменты будут по разному распределятся в этой жидкости. Некоторые ферменты выделены клетками наружу и находятся в к/ж, некоторые сидят в стенках клеток, некоторые заключены в клетки. Ясно, что для выделения первых можно клетки не трогать, просто отделить, а вот для выделения 2-х и 3-х необходимо разрушить клетки.

Процесс разрушения клеточной стенки называют дезинтеграцией. Существуют несколько методов дезинтеграции (разрушения).

-механические: баллистический, экструзионный, декомпрессионный;

-физические: осмос и термошоки, плазмолиз, криотехника, ультразвук, сушка, ионизирующая радиация, температура;

-химические: действие кислот, щелочей, солей, органических растворителей, ПАВ, сдвиг рН;

-энзиматические: действие литических ферментов (лизоцим;

-биологические: действие фагов, антибиотиков.

Чаще всего первой стадией получение ферментов является получение гомогената. Гомогенат получают измельчением биологического материала (растительная или животная ткань, мицелий и т.д.) в ступке с добавлением песка или осколков стекла, или в специальных гомогенизаторах. В настоящие время применяют различные модели гомогенизаторов. Основной принцип работы этих аппаратов заключается в следующим: в стеклянной или металлическом стакане поступательно-вращательно перемешивается хорошо подогнанный к стенкам стакана металлический, стеклянный или фторопластовый шток. Предварительно измельченная биологическая ткань попадая между стенкой и штоком с наконечником механическим разрушаются. Подбирая обороты, тип гомогенизатора, среду можно выделить очень большой класс ферментов.

В последние время очень широко применяют УЗ-дезинтеграторы. Здесь также необходимо подобрать такие условия, чтобы исключить максимально инактивацию ферментов. Хорошим способом разрушения большинства микробных клеток является перематывание шариками, состоящие во встряхивании клеток с маленькими стеклянными шариками в быстро вибрирующем сосуде.

Дезинтегрирующие действие химических соединений заключается в нарушение меж. И внутримолекулярных связей между структурными элементами клеточной стенки за счет связывание ионов металлов, удаление липидов и т.д.

При энзиматической дезинтеграции можно выделять малоустойчивые внутриклеточные структуры. Ферменты или ферментные комплексы литического действия получают из бактерий, грибов, тканей животных и растений. Например, в состав дрожжелитического ферментного комплекса входят различные глюконазы, протеазы, хитиназы. Из-за различия в строение клеточных стенок в зависимости от рода, вида, штамма одних и тех же клеток, в каждом конкретном случае необходимо подбирать соответствующий ферментный комплекс. Особенно большой скачок в использовании энзиматической дезинтеграции был сделан после применение иммобилизованных ферментов.

Биологическая дезинтеграция осуществляется фагами, бактериоцинами вызывающих лизис клетки ведущий и распаду клетки. Если ферменты прочно связаны с внутриклеточными структурами, то вначале выделяют эти структуры дифференциальном центрифугированием, а затем экстрагируют из них ферменты органическими растворителями или водными растворами дозоксихолата, твина и т.д. (детергенты).

Выделение ферментов

Для получения ферментного экстракта можно использовать буферные растворы, растворы солей, воду, смесь глицерина с водой (40% и 60%0, или органические растворители.

Раньше и сейчас для выделения ферментов чаще всего использовали ацетон и спирт. Несмотря на простоту этот способ имеет ряд недостатков. Не все ферменты выдерживают обработку органическими растворителями денатурируют и теряют свою активность. Поэтому эту операцию нужно проводить при очень низких температурах, близких к температуре замерзание смеси данного растворителя с водой.

Наиболее широко применяют для выделения ферментов метод высаливания (рис.1.7)

Высаливание чаще всего производят с помощью сернокислого аммония, добавляемого к исследуемому раствору в возрастающих количествах. Ферментный раствор вначале насыщают (NH4)2SO4 20% % от полного насыщения. При этом выпадает какая то часть ферментов и белков, осадок отделяют на центрифуге и исследуют на наличие соответствующей ферментативной активности. Раствор далее насыщают сернокислым аммонием до 40% полного насыщения, до 60% и т.д., осадки оделяют и получают ряд белковых фракций, которые исследуют на наличие в них того или иного фермента.

Для очистки ферментов применяют водорастворимые полимеры. Их применение основано либо на осаждение ферментов полимерами (полиэтиленгликоль), либо на избирательной распределение ферментов в водных растворах 2-х несшивающихся полимеров (декстран, полиэтиленгликоль).

Хроматографические методы очистки. Адсорбционная хроматография – основана на различие в адсорбционных свойствах компонентов разделяемой смеси.

Главное требование предъявляемое к адсорбенту для хроматографии – отсутствие химического взаимодействия между адсорбентом и анализирующим веществом. Адсорбент не должен оказывать каталитического действия как на растворитель, так и на компоненты разделяемой смеси. Для этого адсорбенты очищают от примесей, нейтрализуют его кислотные и щелочные свойства. Каталитическое окисление можно устранить проводя работу в атмосфере инертного газа.

Второе важнейшие свойство адсорбента – избирательность по отношению к компонентам разделяемой смеси. Адсорбенты разделяют на полярные и неполярные. Адсорбционное сродство полярных веществ к полярным адсорбентам, значительно выше, чем неполярных к полярным.

Третье – размер частиц от которого зависит способность адсорбировать те или иные вещества.

Четвертое – стандартность свойств адсорбента, что обуславливает воспроизводимость и возможность сопоставить результаты.

Пятое – разделенные вещества должны легко отделяться от адсорбента.

В хроматографических исследованиях применяют адсорбенты заводского производства. Один из наиболее распространенных адсорбентов окись алюминия, на которой удается храмотографировать широкий круг смесей как в полярных, так не полярных растворителях благодаря ее атмосферному характеру. Техническая Al2O3 имеет слабощелочную реакцию (рН 9-10). Нейтральную Al2O3 готовят промывая ее азотной или соляной кислотой (разбавленной). Активность Al2O3 зависит от ее влагосодержания (увлажнение).

Для хроматографического разделения смесей нефтепродуктов, высших жирных кислот, углеводов, и др. органических соединений широко применяют силикагель (двуокись кремния). Нейтральный силикагель, который получают промывая дистиллированной водой промышленный силикагель используют при хроматографировании нестабильных веществ.

Несколько меньше применение нашли силикаты кальция и магния, активного угля, целлюлоза, сульфат мания и др.

В последнее время большой интерес вызывают синтетические и природные вещества – молекулярные сита. Это кристаллы синтетических и природных минералов – цеолитов. Промышленностью выпускается четыре типа цеолитов – А, Х, У, М имеющих различное кристаллическое строение. В цеолите могут включены различные катионы. Марки цеолитов в зависимости от катионов обозначаются: К+А, СаМ, КУ, СаУ.

Пары этих кристаллов имеют размеры, близкие к размерам молекул жидких и газообразных веществ (0,8-0,2 нм). Те вещества, молекулы которых по своим размерам могут проникнуть в эти поры, сорбируются в кристаллах цеолитов, а более крупные молекулы остаются несорбированными. Использование цеолитов с различными размерами пор, дает возможность очень четко разделить на цеолитах смеси различных веществ. Природные цеолиты – большая группа минералов, являющихся водными алюмосиликатными кальцием, натрием и др. металлов.

Правильный выбор растворителя (подвижной фазы) в адсорбционной храмотографии имеет существенное значение и тесно связан как с природой выбранного адсорбента, так и со свойствами компонентов анализируемой смеси. Основным показателем для растворителя является его десорбирующая способность.

Распределительная хроматография. Основано на различии в коэффициентах компонентов разделяемой смеси между двумя несмешивающихся (или частично) жидкостями, в которых компоненты растворяются, причем одна из жидкостей (неподвижная фаза) удерживается твердым носителем (инертным). Растворители прежде всего должны хорошо растворять все компоненты анализируемой смеси, минимально адсорбироваться на выбранном адсорбенте, не взаимодействовать химически с анализируемым веществом, ни с адсорбентом. Выбор растворителей объясняется тем, что они значительно влияют на прочность адсорбции. Чем больше полярность адсорбируемого вещества по сравнению с растворителем, тем прочнее оно связывается с адсорбентом. Наоборот, если степень адсорбции вещества и растворителя близки, то адсорбированная вещество вытесняется молекулами растворителя, и степень адсорбции вещества понижается. Поэтому, часто проводят последовательное вымывание вещества рядом растворителей с увеличивающейся десорбционной способностью. В результате отдельные компоненты смеси десорбируются и вымываются из колонки последовательно.

Растворитель (подвижна фаза) продвигается через неподвижную фазу и увлекает разделяемые вещества, находящиеся на носителе. В процессе хроматографирование происходит распределение компонентов между подвижной и неподвижной фазами до тех пор, пока не будет достигнуто состояние равновесие. Константа равновесия зависит от выбранных растворителей и от природы хроматографируемого вещества. Эту величину К называют коэффициентом распределения Нерста:

С- молярные концентрации вещества в обоях фазах

Благодаря различию в значение К индивидуальные вещества перемещаются в колонке с разной скоростью и благодаря этому достигается их разделения. В зависимости от природы твердого носителя и свойств жидкой неподвижной фазы, а также способа проведение эксперимента распределительная хроматография делится на колоночную (КХ), тонкослойную (ТСХ) и бумажную (БХ). В распределительной КХ и ТСХ может быть применен любой другой твердый носитель, который прочно удерживает неподвижную фазу, и не вызывает побочных явлений. В качестве таких носителей чаще всего применяют силикагель, гипс, цеолиты, крахмал и т.д. в качестве носителя неподвижной жидкой фазы в бумажной хроматографии применяют специальную бумагу, способную удерживать в порах много жидкости, являющейся неподвижной фазой.

Гель - хроматография. Некоторые полимеры обладают способностью содержать значительное количество прочного связанного растворителя. Если этот неполярный растворитель, то гель называется гидрофобным, а если вода – гидрофильным. Хотя при этом мелкие частицы геля и выглядят сухими, масса содержащегося в них растворителя часто во много раз превышает массу самого геля. Так, в сефадексе G20 на 1г сухого геля содержится 20 г связанной воды. В качестве гидрофильных гелей используют чаще всего гели из полиакриламида, агар-агара и декстрана, в качестве гидрофобных – гели, которые набухают в органических растворителях. Разделение на гелях основано на том, что растворенные вещества распределяются в зависимости от размеров их молекул и размеров пор геля между растворителем, играющим роль подвижной фазы, и тем же самым растворителем, содержащимся в геле (стационарная фаза). Таким образом, разделение осуществлено способностью растворенных частиц проникать в поры геля, т.е. различной способности их к диффузии. Разделяемые вещества должны иметь малое сродство к гелю, чтобы не накладывались адсорбционные взаимодействия. Гели используются не только для разделения крупных органических молекул от мелких – гель – фильтрация; но и для оценки молекулярных масс компонентов – гель – хроматография (Рис.1.8).

Ионообменная хроматография – это обратимый обмен ионов, содержащихся в растворе, на подвижные ионы вещества называемых ионитами или ионообменниками. Разделение смеси содержащихся в растворе ионов основано на не одинаковой способности их к обмену с ионами ионита. Ионообменники – это нерастворимые высокомолекулярные соединения, содержащие способные к ионизации функциональные группы и дающие с ионами противоположного заряда нерастворимые соли. В зависимости от характера ионизирующих групп иониты разделяют на катиониты и аниониты. Существуют также амфолиты – способные осуществлять одновременный обмен катионов и анионов (Рис.1.9).

Давай для простоты представим, что ионит состоит из каркаса (или замкнутой сетки), обладающего (+) и (–) зарядом, который компенсируется зарядами ионов противоположительного знака (противоионов), так что в целом ионит нейтрален. За счет подвижности противоионов в пределах каркаса, ионит способен к обмену. Если, например, ионит, содержащий противоионы А, поместить в раствор, в котором находятся ионы В того же заряда, то ионы А будут покидать ионит и переходить в раствор, а ионы В будут связываться с ионитом:

RAn-H⁺+Na⁺+Cl- ↔ RAn- Na⁺+H⁺+Cl- катионный обмен

RKt+ OH^-+Na⁺+Cl^- ↔ RKt+Cl^-+Na⁺+OH^- анионный обмен

R – полимерный радикал, образующий вместе с ионогенной группой каркас ионита, An^- и Kt⁺ ионогенные группы или фиксированные ионы, обуславливающий заряд каркаса.

Афинная хроматография. А сейчас мы более менее подробно остановимся на одном из методов хроматографии - афинной хроматографии. Это метод еще называют биоафинной ли биоспецифической хроматографией.

Суть этого метода заключается в том, что многие биологически активные соединения – ферменты, лектин имеют исключительную способность специфически и обратимо связываться с другими веществами, которые принято называть лигандами, афинными лигандами или просто афинатами. Например: фермент – ингибитор (субстрат), антитело – антиген, лектин – клеточная стенка. Если такой лиганд (л) ковалентно соединить с нерастворимой инертной матрицей (м), то получится специфический адсорбент, на котором будет адсорбироваться только вещества (в), имеющие сродство к данному лиганду. Остальные же вещества будут проходить через колонку (Рис.1.10).

Варьируя условия процесса и используя специальные элементы, изменяющие сродство лиганда к выделяемому веществу, можно вызвать десорбцию и получить высокоочищенный необходимый препарат. Подбор носителя к лиганду – задача очень сложная. Редко можно найти лиганды в виде существующих соединений, имитирующих субстраты или являющиеся настоящими субстратами, которые можно использовать при создании афинных сорбентов. Это прежде всего, крахмал, пектин, целлюлоза. В большинстве случаев афинные адсорбенты требуется синтезировать с учетом свойств очищаемого вещества. Этот процесс имеет и другие сложности. Например, сорбенты могут быть невысокоспецифичными и удерживать не только очищаемое вещество, но и ряд других, осложняет и удлиняет очистку. Для афинной хроматографии используются различные нерастворимые сорбенты, но чаще всего получают поперечно-сшитые гранулы агарозы, т.к. они достаточно прочные, не разрушаются и сохраняют форму под давлением, при смене буфера или в присутствии различных растворителей.

К лигандам предъявляются ряд жестких требований: они так должны присоединяться к матрице, чтобы не был затруднен подход вещества к лиганду; желательно, чтобы между матрицей и лигандом был мостик, что облегчает доступ к лиганду; необходимо, чтобы лиганд не взаимодействовал с другими соединениями, имел прочную связь с матрицей, котором была бы стабильна при адсорбции вещества, его последующей элюации, регенерации и очистке колонки с адсорбентом.

Широкому внедрению афинной хроматографии способствовало создание методов получения моноклональных антител, обладающий чрезвычайно высокой константой связывания с соответствующим антигеном (белок или другое вещество).

Клон – культура состоящая из наследственно идентичных клеток, возникающих в результате бесполого размножения «моноклональные (гомогенные) антитела – это антитела однородные по своей структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченном количестве.

Для предотвращение концентрационной поляризации используют различные приемы: качественная предварительная очистка растворов, установление мешалки, уменьшение просвета между мембранами.

Для устранения начальной адсорбции используются предварительное фильтрование концентрированного раствора через металлокерамические фильтры, центрифугирование и т.д.

С этой точки зрения эффективна химическая обработка раствора, при которой удаляется часть балластных веществ солями, бентонитом и т.д., а также изменение рН до изоэлектрического значения, при котором осаждаются балластные вещества.

Электрофорез и изоэлектрофокусирование. Для разделения и очистки ферментов в настоящее время очень широко применяется электрофорез в различных гелях – полиакриламидном, агарозном, крахмальном и т.д., насыщенным буферным раствором.

Разделение ферментов методом электрофореза основано на различии подвижности заряженных белковых молекул под действием электрического поля. Для проявления белков после электрофореза их фиксируют уксусной или трехуксусной кислотами и окрашивают кумаси, амидочерным или другими белковыми красителями (Рис.1.11).

Получаются студенистые цилиндрические брусочки с окрашенными полосками. На специальном приборе денситометре по степени окраски, ширине окрашенной полосы и с использованием свидетелей определяют качественную и количественному характеристики белков.

Кроме того, для идентификации ферментов в геле окрашивают продукт данной ферментативной реакции, учитывая активность ферментов.

Более высокой разрешающей способностью отличается диск – электрофорез в полиакриламидном геле, при котором используется неоднородная буферная система и белки концентрируются в узких зонах.

Очень хорошие результаты получают при использовании другой разновидности электрофореза – изотахофореза – препаративного электрофореза в неоднородной буферной системе с использованием амфолинов. При изотахофорезе заряженные молекулы белков и амфолинов располагаются в соответствии с их подвижностью между быстрыми ведущими и медленными замыкающими ионами и движутся с одинаковыми скоростями. Использованием амфолинов позволяет разделить ферменты, близкие по электрофоретической подвижности, которые трудно разделить обычным зональным электрофорезом.

Наиболее высокой разделяющей способностью обладает метод изоэлектрической фокусировки белков, разработанный Свенсоном и Вестербергом. При этом методе ферменты разделяются за счет различий их изоэлектрических точек. Фракционирование белков проводят в колонке, заполняют синтетическими амфолинами – смесью алифатических полиаминов поликарбоновых кислот. Сочетание аминых и карбоксильных групп каждого отдельного амфолина смеси определяет характер его диссоциации. Под действием электрического поля амфолины распределяются по высоте колонки в строго определенной последовательности и создают линейный градиент рН. В электрическом поле колонки молекулы внесенного в ее белка перемещаются к аноду или катоду. При этом они проходят зоны с различными значениями рн. В зоне, где рН точно соответствует значению изоэлектрической точки белка, его молекулы становятся электронейтральными и их движение прекращается – белок фокусируется. Т.о. в разных зонах колонки фокусируются белки с разными значениями изоэлектрических точек различающихся на 0,02 рН.

В процессе выделения ферментов проводят их концентрирование, т. е. удаление низкомолекулярных примесей. Наиболее эффективными методами являются диализ и ультрафильтрация. УФ – это фильтрация под давлением через мембраны, действующим как молекулярный фильтр. Для концетрирования используют миофильную сушку, выпаривание в вакууме и т.д.

В промышленности ферментные препараты различной степени чистоты – от целых клеток и бесклеточных экстрактов до высокоочищенных гомогенных ферментов – применяют в качестве биокатализаторов. В промышленных масштабах получать высокоочищенные ферменты очень сложно, т.к. при использовании для этой цели наиболее эффективных, вышеприведенных методов требуется решить целый ряд инженерно-технологических, дорогостоящих задач.

Эти трудности можно обойти несколькими путями:

- использовать более доступные и дешевые методы получения очищенных ферментных препаратов – концентрирование, экстракция, осаждение;

-получать мутантные микроорганизмы с легко разрушающимся клеточными стенками или использовать иммобилизованные литические ферменты.

-создавать биоспецифические процессы выделения и очистки с использованием АСУ ТП.

- и наконец, видимо самое перспективное вместо ферментов использовать целые иммобилизованные клетки обладающие заданной ферментативной активностью.