1.4.5. Экспериментальная оценка кинетических параметров ферментативных реакций при полном конкурентном ингибировании
В координатах Лайнуивера-Берка. Если это так, т.е. VМ не изменяется, а КМ изменяется, то при любой концентрации I экспериментальные данные υ0 от [S]0 должны образовать в координатах Лайнувера-Бэрка прямую пересекающую ось ординат в (1) 1/ V.
Если проводить эксперименты при изменяющийся концентрации ингибитора, то на графике Л-Б будет получаться пучок прямых пересекающихся в одной точки на оси ординат, отсекая отрезок 1/ V( Рис.1.30 )
.
Так как каждая из прямых будет отсекать
на оси абсцисс отрезок равный – 1/КМ,
то из найденных этим способом значений
КМ легко найти КS и КI строя линейную
зависимость в координатах
(Рис.1.31 )
(9)
Если значения VМ и КS для фермента известны и требуется найти лишь константу ингибирования КI, удобно использовать координаты Диксона, сязывающие 1/υ0 с [I].
Обратим уравнение
Из уравнения следует, что в координатах 1/υ0 = f[I] можно получить пучок прямых, угол наклона которых будет определяться начальной концентрацией субстрата.
Проанализируем уравнение 10.
Если [I].= - КI, то заменим [I].на - КI во втором
слагаемом
итого
,
т.е.
Так как при конкурентном ингибировании VМ не меняется, то пучок прямых будет проходить через точку с абсциссой - КI и пересекается в точки ординаты +1/ VМ (Рис.1.32).
Т.о. при полном конкурентном ингибировании серия экспериментов по зависимости начальной скорости от концентрации ингибитора при различных начальных концентрациях субстрата S0 и постоянном значение Е0 дает в координатах Диксона пучок прямых, пересекающихся в одной точке. Ее абсцисса позволяет найти константу нестойкости фермент ингибиторного комплекса.
1.4.6. Кинетика ферментативной реакций при неконкурентном ингибировании.
Если последовательные реакции: (1) и (2)
E+S ↔ES KS
E+I↔ EI Ki
ES →E+P
Дополнить реакциями
EI+S ↔EIS KSа (11)
ES+I ↔EIS Kiа (12)
То мы получим модель полного неконкурентного ингибирования. Как видим в этом случае еще образуется малоактивный комплекс EIS, причем сродство субстрата к катализатору не зависит от присоединения к нему ингибитора.
В то же время, мы примем, что связывания субстрата не связывается на сродство фермента к ингибитору. Тогда получается, что KSа и Kiа в уравнениях (11) и (12) идентичны соответствующим константам диссоциации в уравнениях (1) и (2).
Причем также, что комплекс EIS не диссоциируется с образованием продукта реакции Р. понижение скорости реакции связано с переходом некоторой части катализатора в комплексе с EI и неактивный или малоактивный комплекс EIS. Тогда аналогично случаи с конкурентом ингибированием, т.е. с учетом равновесности реакций (1), (2), (11) и уравнения материального баланса по ферменту можно получить следующее выражение для скорости реакций.
(13)
Нетрудно заметить, что это уравнение совпадает по форме с уравнением М.-М., причем константа Михаэлиса осталась без изменений, а максимальная скорость реакции снизились и стала зависимой от концентрации ингибитора.
(14)
Отсюда следует, что присутствии конкурентного ингибитора добавление к реакционной смеси сколь угодно большого количества субстрата не позволит повысить максимальную скорость реакций до той величины, которая может быть достигнута в отсутствии ингибитора.