2.5 Применение иммобилизованных биокатализаторов в медицине
В настоящие время природные физиологически активные вещества (ФАВ) белковой природы, в первую очередь ферменты рассматривают как перспективное средство медикаментозного лечения вследствие их чрезвычайности высокой активности и специфичности. Однако некоторые недостатки ферментов препятствуют их действительно широкому применению в практической медицине. Это мобильность в физиологических условиях, быстрое выведение из организма и разрушение под действием эндогенных протеаз, антигенность как чужеродных организму белков; нередко токсичность и малая доступность, дороговизна. Анализ сложившегося положения привел ученых к выводу, что эти недостатки в большинстве случаев можно устранить если использовать в практической медицине не нативные ферменты, а их иммобилизованные производные.
Иммобилизация белковых лекарственных препаратов проводится на носителях, которые сами по себе не должны оказывать осложняющих влияний и способствуют проникновению фермента к желанной цели. Конечно, применяемый полимер и сшивающий агент должны быть нетоксичными, кроме того, следует исключить возможность повышения токсичности при биодеградации коньюгата. А если фермент иммобилизуется на нерастворимом носители с острыми углами, он не должен деформировать форменные элементы биологических жидкостей.
Лекарственные вещества белкового или пептидного происхождения, иммобилизованное на соответствующем носителе, представляет собой структуру, модель которой представлен на рис. 2.16. Из рисунка следует, что возможны значительные вариации иммобилизованного лекарственного препарата. Например, если полимер растворим то не требуется солюбилизирующего агента. Если лекарство заключено в полимерную оболочку (капсулу) и действует на проникающий внутрь капсулы субстрат или катализирует превращение внешнего субстрата при постепенной деградации оболочки, то не требуется химического связывания.
Желаемые свойства (растворимость, нетоксичность, специфичность) может быть достигнута при связывании белка с полимерной целью, которая в свою очередь модифицируется определенным способом. К примеру, известно, что высокомолекулярное соединение само по себе не может проникнуть внутрь клетки путем диффузии, но попадает в нее путем эндоцитоза, если для этого полимер снабжен химическими группами, специфично взаимодействующими с клеточной мембраной.
Рис. 2.17. Модель структуры лекарственного препарата
Вообще то нужно стремиться к созданию препаратов, в которых отмечалось бы высокое содержание лекарства по отношению количеству носителя. Так как молекулярные массы белка и полимера примерно одного порядка, то на одной молекуле растворимого полимера часто оказывается не более одной молекулы белка, часть полимера сопровождает лекарственный препарат как балласт. Если полимер содержит заряженные группы можно ожидать большого связывания, поскольку образуются нековалентные комплексы, разделить которые удается только при высокой ионной силе раствора. Такие комплексы могут вести себя как «депо» лекарственного средства, находящегося в нативном состоянии.
Препараты ферментов повышенной молекулярной массы могут быть изготовлены путем немолекулярного сшивания бифункциональными реагентами. Такие препараты стабильны в физиологических условиях, большая молекулярная масса исключает немедленное их выведение почками.
Одними из перспективных направлений лечения ряда заболеваний являются методы, основанные на гемосорбции и лимфосорбции. Эти методы основаны на пропускании крови через колонку, заполненную соответствующим носителем с или без иммобилизованного фермента. Носители сорбирующих колонок содержат специфические соединения, способные связывать токсины, находящиеся в организме. Иногда удобнее применять твердые носители, содержащие ферменты. Основное требование к ним – они не должны вызывать деформацию ферментных элементов крови. Модификация таких носителей (стекло, керамика, силикаты) для придания им групп, связывающих белки, проводится методами, заставляющим вступать в реакции с ОН- группами носителей. Исходный материал для матрицы должен выбираться таким, чтобы наблюдалась минимальная специфическая сорбция.
К лекарственным препаратам, иммобилизованных на твердых носителях, можно отнести, также перевязочные материалы, содержащие обычно протеолитические ферменты, которые применяются для очищения гнойных ран.
Лекарственные препараты, в которых соотношение белок: полимер по массе очень высокое и достигает сотен тысяч и выше, могут быть изготовлены с помощью метода «искусственной клетки» и липосом. Они представляют собой микросферы с проницаемой оболочкой.
Первым типом «искусственных клеток» являются микрокапсулы Чанга (1965 г). Микрокапсулированные препараты ферментов представляют собой крошечные реакторы диаметром от 103 до 5 104 нм, тонкая оболочка которых (200-400 нм) проницаема для низкомолекулярных соединений. Фермент, находящийся внутри оболочки, не контактируют с жидкостями и тканями организма не разрушается протеиназами, не ингибируется, не вызывает иммунного ответа организма. Основное достоинство микрокапсулы заключается в том, что их можно имплантировать в нужное место, например в непосредственной близости от опухоли, для переработки метаболитов способствующих росту опухолевой ткани.
Микрокапсулы с белковым содержимым готовятся следующим образом. Создается микроэмульсия водного раствора вещества в органическом растворителе. Полимерный материал растворен во внешней фазе, к которой добавляют вещества, способствующие его осаждению на капле эмульсии. Растворы содержат также мономеры, полимеризующиеся на границе раздела фаз. Однако следует учесть, что в этом случае большой отрицательный вклад вносят диффузионные ограничения. Фермент, включенный в капсулу, может быть предварительно стабилизирован. Иногда капсулы могут содержать микроскопические участки тканей. Например, есть экспериментальные данные по созданию депо инсулина путем имплантации микрокапсулы, содержащих островки Лангерганса, синтезирующие в поджелудочной железе инсулин.
Полимерная стенка микрокапсулы обычно изготавливается из прочных полимеров. Следует учитывать, что микрокапсулы, вводимые в кровь, могут забивать кровеносные сосуды, и следовательно являться причиной образования тромбов. Однако эффективность микрокапсул при использовании их в виде колонок для диализа в аппарате типа «искусственная почка» несомненна. При этом объем аппаратов и соответственно, количество необходимых и очень дорогих растворов резко сокращается.
Сейчас интенсивно исследуется свойства микрокапсул, стенка которых состоит из оболочек эритроцитов. Оболочка эритроцитов, без содержимого называется «тенью». Вот такие тени заполняют ферментом. Большой выигрыш в этом случае заключается в том, что носитель совместим с организмом пациента.
Введение лекарственных препаратов в клетки можно решить созданием контейнеров – переносчиков типа липосом и мицелл. Оболочка может представлять собой однослойную или многослойную поверхность, образованную в свою очередь бислойной структурой, созданной соединениями, имеющими гидрофильную группу и две достаточно длинных гидрофобных участка. Яркими представителями этих соединений являются фосфолипиды. Фосфолипиды содержащие насыщенные углеводородные цепи плавятся при физиологических температурах. Для каждого типа фосфолипидов имеется определенная температура, при которой твердая структура плавится.
Липосомы образуются путем обработки УЗ водной дисперсии липидов выше температуры их застывания или впрыскиванием спиртового раствора липида в водную фазу. Лекарство может быть введено внутри липосомы, если оно гидрофильно, или в стенку, если оно гидрофобно. Диаметр липосом от 20 до 103 нм и поэтому применять их как контейнеры для доставки ферментов нецелесообразно, если нет возможности с точностью нацелить липосому на определенную клетку. Однако липосомы имеют и преимущества, т.к. их поверхность легко может модифицироваться, они могут адсорбироваться на клетке и поглощаться ею путем эндоцитоза.
Словарь терминов используемых в курсе “Ферментативный катализ с основами инженерной энзимологии”
Аденозинтрифосфат - нуклеотидный кофермент [АТФ (АТР)] является наиболее важной формой сохранения химической энергии в клетках. Расщепление АТФ — высоко экзоэргическая реакция. Химическая энергия гидролиза АТФ может использоваться для сопряжения с эндоэргическими процессами, такими, как биосинтез, движение и транспорт.
Антигены (от анти... и греч. génos - рождение, происхождение) - высокомолекулярные коллоидные вещества, которые при введении в организм животных и человека вызывают образование специфических реагирующих с ними антител. Свойствами антигена обладают чужеродные для организма белки и полисахариды.
Антитела - белки глобулиновой фракции сыворотки крови, образующиеся в ответ на введение в организм человека или теплокровных животных бактерий, вирусов, белковых токсинов и других антигенов.
Апофермент (apoenzyme) - апоэнзим, коллоидальная, белковая часть фермента, обусловливающая специфичность его действия. Характеризуется, как правило, в отличие от кофермента, неустойчивостью к нагреванию и другими свойствами белков.
Биосенсор – устройство, в котором чувствительный слой, содержащий биологический материал: ферменты, ткани, бактерии, антитела/антигены, липосомы, и тд. непосредственно реагирующий на присутствие определяемого компонента, генерирует сигнал, функционально связанный с концентрацией этого компонента.
Буферные системы, буферные растворы, буферные смеси, системы, поддерживающие определённую концентрацию ионов водорода Н+, то есть определённую кислотность среды.
Гели - (от лат. gelo- застываю), - дисперсные системы с жидкой дисперсионной средой, в которых частицы дисперсной фазы образуют пространств. структурную сетку. Представляют собой твердообразные ("студенистые") тела, способные сохранять форму, обладающие упругостью (эластичностью) и пластичностью.
Гетерогенная система (от греч. heterogenes - разнородный) - неоднородная физико-химическая система, состоящая из различных по физическим свойствам или химическому составу частей (различных фаз).
Гомогенная система (от греч. homogenes - однородный) - физическая система, не содержащая частей, отличающихся по составу или свойствам и отделённых друг от друга поверхностями раздела.
Зимоген (профермент) - неактивная форма фермента, переходящая под воздействием различных физиологических и биохимических факторов в активную форму. Образование профермента предотвращает саморазрушение клеток и тканей, в которых осуществляется биосинтез ферментов.
Изоферменты - ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но различающиеся по структуре, физико-химическим и иммунологическим свойствам.
Ингибитор ферментов - природное или синтетическое вещество, угнетающее активность ферментов или полностью прекращающее их деятельность. Ингибиторы ферментов используются для изучения механизма действия ферментов, для лечения нарушений обмена веществ, а также в качестве пестицидов.
Катализ (от греч. katálysis - разрушение), изменение скорости химических реакций в присутствии веществ (катализаторов), вступающих в промежуточное химическое взаимодействие с реагирующими веществами, но восстанавливающих после каждого цикла промежуточных взаимодействий свой химический состав.
Константа Михаэлиса - один из важнейших параметров кинетики ферментативных реакций, введённый немецкими учёными Л. Михаэлисом (L. Michaelis) и М. Ментен в 1913, характеризует зависимость скорости ферментативного процесса от концентрации субстрата.
Кофактор [от лат. co (cum) - вместе и factor - делающий] - небелковое химическое соединение, необходимое для проявления максимальной активности многих ферментов.
Кофермент - органическое соединение небелковой природы. Коферменты входят в состав некоторых ферментов. Соединяясь с апоферментом, коферменты образуют каталитически активные комплексы.
Окислительно-восстановительный потенциал - равновесный электродный потенциал, характеризующий данную электролитическую среду.
Поверхностно активные вещества - вещества, адсорбция которых из жидкости на поверхности раздела с др. фазой (жидкой, твердой или газообразной) приводит к значительному понижению поверхностного натяжения.
Полисахариды - высокомолекулярные соединения из класса углеводов; состоят из остатков моносахаридов (М), связанных гликозидными связями. Молекулярные массы полисахаридов лежат в пределах от нескольких тыс. (ламинарин, инулин) до нескольких млн. (гиалуроновая кислота, гликоген) и могут быть определены лишь ориентировочно, т.к. индивидуальные полисахариды обычно являются смесями компонентов, различающихся степенью полимеризации.
Солюбилизация (от позднелатинского solubilis - растворимый) - коллоидное растворение, самопроизвольное и обратимое проникание какого-либо низкомолекулярного вещества (солюбилизата), слабо растворимого в данной жидкой среде, внутрь находящихся в ней мицелл поверхностно-активного вещества или молекулярных клубков (глобул) высокомолекулярного соединения.
Ферментативный катализ, биокатализ, ускорение химических реакций под влиянием ферментов.
Ферментер - аппарат для глубинного выращивания (культивирования) микроорганизмов в питательной среде в условиях стерильности, интенсивного перемешивания, непрерывного продувания стерильным воздухом и постоянной температуры.
Ферменты (от лат. fermentum - закваска) (энзимы) представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных химических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращение огромного множества разнообразных химических соединений.
Флавинадениндинуклеотид - рибофлавин-51-аденозиндифосфат, небелковый компонент (кофермент) большинства ферментов-флавопротеидов, присутствующих во всех живых клетках; производное рибофлавина (витамина B2).
Электрофорез (от электро и греч. phoresis - несение, перенесение), направленное движение коллоидных частиц или макроионов под действием внешнего электрического поля.