2.3.3. Применение изомераз.
Изомеразы относятся к 5 классу ферментов, катализируют реакции изомеризации. Из этого класса ферментов в промышленности широкое применение нашла глюкозоизомераза. Существует несмколько типов глюкозоизомеризующих ферментов, но не все они обладают подлинной глюкозоизомерующей активностью. Практическое применение нашел только фермент – D-ксилозокетоизомераза, КФ 5.3.1.5., применяющийся для производства глюкозо-фруктозного сиропа (ГФС) и фруктозы. Это связано с тем, что данный фермент не требует присутствия NAD+ в реакционной среде и обладает высокой термостабильностью. В связи с практическим назначением его называют глюкозоизомеразой (ГЛИ).
Фруктоза или фруктовый (плодовый, медовый) сахар по сравнению с обычным пищевым сахаром, в состав которого фруктоза также входит, но в виде химического соединения с менее сладкой глюкозой, обладает более приятным вкусом. Она на 70% слаще сахара и потреблять ее можно в меньших количествах. Это очень важно для больных сахарным диабетом, т.к. усвоение фруктозы не связано с инсулином. Сахар (сахарозу) нельзя заменить D-глюкозой, поскольку глюкоза менее сладкая. Этот недостаток можно устранить, если глюкозу частично изомеризовать во фруктозу ГЛИ.
Во многих странах освоена технология получения эффективных иммобилизованных биокатализаторов с глюкозоизомеразной активностью, многие из которых уже внедрены в производство. Наиболее известные препараты получены следующим образом: адсорбцией ферментного экстракта на ДЕАЕ-целлюлозе или на пористом алюминие или на ионообменных смолах; включением ферментного препарата в желатиновый гель с последующей сшивкой глутаровым диальдегидом или в полые волокна триацетата целлюлозы.
Для выбора типа иммобилизованного биокатализатора, конструкции реактора, условий каталического процесса в реакторе необходимо проведение большой предварительной работы. Это хорошо видно на примере того, какие параметры исследовали аАмериканские исследователи при внедрении в производство технологии получения кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы с использованием иммобилизованной ГЛИ.
Биохимические параметры – активность препарата; стабильность фермента (время жизни и полуинактивации); производительность в используемом диапазоне времени жизни; оптимальная концентрация субстрата; влияние концентрации субстрата; влияние концентрации олигосахаридов; влияние растворенного кислорода; минимальное и максимальное время контакта с субстратом; образование побочных продуктов реакции; чувствительность к изменению рН и температуры; устойчивость при хранении; вымываемость фермента; рост микроорганизмов; характеристики потока на выходе (состав, цвет, запах, рН, содержание белков и т. д.).
Механические параметры – размер, форма частиц и распределение по размерам; насыпная масса в сухом и влажном виде; набухание; сжимаемость; когезия; истирание частиц.
Гидромеханические параметры – перепад давления; тип потока (восходящий или нисходящий); уплотнение слоя; осевая дисперсия и каналообразование; распределение времени пребывания; расслаивание; отношение длины к диаметру4 минимальная скорость начала псевдожижжения.
В ходе анализа вышеприведенных параметров был выбран биокатализатор со следующими свойствами:
-форма катализатора – сухие гранулы; внешний вид – окрашен в желто-коричневый цвет; размер частиц, меш – наименьший размер 12 х 20; объемная плотность в сухом состоянии, г/см3 – 0,64-0,72; объемная плотность во влажном состоянии, г/см3 – 0,2; характерный размер пор, мкМ – 0,2; активность, ед/г – не менее 0,04; производительность – до 907 кг 42%-ного обогащенного фруктозой сиропа на 0,45 кг фермента в течение 1000 ч; объем пустот в слое – 45%.
Выбранный размер частиц биокатализатора удовлетворял двум взаимоисключающим требованиям: с одной стороны, частицы биокатализатора достаточно малы, чтобы скорость диффузии не лимитировала скорость всего процесса, а с другой стороны размеры достаточно велики, чтобы свести к минимуму перепад давления на реакторе колонного типа со слоем иммобилизованного фермента. Ниже приводятся оптимальные условия выбранные экспериментальным путем: - содержание сухого вещества , % - 40-45; содержание глюкозы в исходной смеси, % - 93 – 96; требования к исходной смеси – смесь необходимо очистить фильтрованием, обработкой активированным углем и ионообменными смолами; рН – 8,2 – 8,5; падение рН – на 0,2 – 0,4; температура, 0С – 60; активатор, 4 *10-4 М Mg2+; время контакта фермента с субстратом, ч – 0,5 - 4;
Как следует из условий, для того чтобы процесс шел нормально необходимо высокое содержание глюкозы в поступающей в реактор смеси. Если в нем содержание олигосахаридов превышает 10% наблюдается снижение активности биокатализатора. Большой диапазон времени (0,5 – 4 ч) контакта биокатализатора с субстратом объясняется постепенной инактивацией катализатора. С течением времени активность фермента падает и при постоянной скорости потока реагентов степень превращения субстрата постоянно снижается. Поэтому для обеспечения необходимого качества продукции, по мере инактивации фермента, время его контакта с субстратом увеличивают путем уменьшения скорости потока. Необходимо иметь в виду, что размеры реакторов колонного типа определяются гидромеханическими свойствами биокатализатора. При нисходящем потоке реакционной смеси слой иммобилизованного фермента может сжиматься под давлением, в результате этого сопротивление потоку падает. Учитывая известное время контакта биокатализатора с субстратом и заданную производительность всей установки, можно определить размеры и количество колонных реакторов. В данном случае, в силу возможности инактивации биокатализатора целесообразно установить несколько колонн, так чтобы они инактивировались и, соответственно заменялись последовательно. Это позволит максимальным образом использовать биокатализатор и в то же время обеспечить постоянно высокую производительность установки в целом. Технологическая схема процесса производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы, основанного на использовании иммобилизованной ГЛИ представлена на рисунке 2.13. В этой технологии, для эффективной работы фермента, необходимы множество операций предварительного разделения и и обработки промежуточных продуктов между стадиями получения глюкозы из крахмала (осахаривания) и изомеризациией. Для повышения термической устойчивости α – амилазы, применяемой для гидролиза крахмала при температуре 1050С, добавляют ионы кальция. А ионы кальция ингибируют ГЛИ, поэтому, перед поступлением глюкозы в реактор изомеризации, их удаляют из среды связыванием Ионообменными смолами.
В России получен оригинальный иммобилизованный препарат клеток Streptomyces albogrisedus с глюкозоизомеразной активностью. Иммобилизацию клеток проводили путем включения в матрицу состоящую из 2-х гелей – гидроокси Со2+ и хитозана. Термообработанные клетки, влажностью 90% суспендировали в 6 мл 3%-ного раствора приготовленного на основе 18%-ного ацетата кобальта.
Смесь гомогенезировали и по каплям добавляли к *5-ному водному раствору аммиака. В качестве субстрата использовали 2 М раствор глюкозы содержащей 5*10-3 М MgSO4 * 7H2O. Ионы кобальта выполняли роль стабилизатора. Испытания на пилотной установке в лабораторных условиях дали неплохие результаты.
Рис.2.13 - Технологическая схема производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы.1- резервуар для ожижения и осахирования крахмала; 2- фильтр; 3- резервуар для очистки активированным углем; 4- ионообменник (связывание кальция); 5- концентратор; 6- подготовка смеси; 7- колонны с иммобилизованными ферментами; 8- резервуар для очисткт активированным углем; 9- катионообменник; 10-анионообменник; 11 –резервуар для упаривания; 12-резервуар для охлаждения