- •Глава 1.
- •1.1.1 Предмет и задачи ферментного катализа и инженерной энзимологии
- •1.1.2. Первичная структура белка
- •1.1.3. Основы термодинамики. Типы связей в белках и энергетика.
- •1.1.4. Конформация пептидов. Вторичная структура белков
- •1.1.5. Структура глобулярных белков. Третичная и четвертичная структура.
- •1.2.2. Методы выделения и очистки ферментов
- •1.2.3. Единицы активности ферментов. Методы определения активности ферментов.
- •1.3.1.Класссификация ферментов.
- •1.3.2.Коэнзимы и другие кофакторы
- •1.3.3.Фермент-субстратные комплексы и механизм действия ферментов.
- •1.3.4.Кинетика ферментативных реакций.
- •1.3.5. Влияние температуры на ферментативные реакции.
- •1.3.6. Влияние рН на ферментативные реакции.
- •14.1. Эффекторы ферментов. Механизмы регуляции ферментных реакций.
- •1.4.2 Механизмы конкурентного ингибирования ферментативных реакций.
- •1.4.3. Механизмы неконкурентного (аллостерического) ингибирования ферментных реакций.
- •1.4.4.Кинетика ферментных реакций при конкурентном ингибировании.
- •1.4.5. Экспериментальная оценка кинетических параметров ферментативных реакций при полном конкурентном ингибировании
- •1.4.6. Кинетика ферментативной реакций при неконкурентном ингибировании.
- •1.4.7. Экспериментальная оценка кинетических параметров ферментативных реакций при полном неконкурентном ингибировании.
- •1.4.8. Субстратное торможение.
- •Глава 2.
- •2.1.Носители для иммобилизации ферментов и клеток
- •2.2.1.Физические методы иммобилизации ферментов
- •2.2.2. Химические методы иммобилизации
- •2.3.1. Гидролитические ферменты
- •2.3.2. Применение лиаз.
- •2.3.3. Применение изомераз.
- •2.3.4.Применение оксидоредуктаз.
- •2.4.Применение иммобилизованных ферментов в микроанализе.
- •2.5 Применение иммобилизованных биокатализаторов в медицине
2.3.1. Гидролитические ферменты
Гидролазы относятся к третьему классу ферментов. Общим свойством ферментов этого класса является то, что они катализируют реакции гидролиза, т.е. расщепление более сложных соединений на более простые с присоединением воды. Этот класс подразделяется на 11 подклассов. Многие гидролазы компартментализированы в тех или иных структурных элементах клетки, отделенных от цитоплазмы мембранами. Видимо такая локализация гидролаз защищают важные биополимеры цитоплазмы от деструкции. Грамположительные бактерии выделяют в среду много гидролаз. У грамотрицательных бактерий хранилищем для различных гидролаз служит периплазматическое пространство наружной оболочки, ограниченное двумя мембранами. В клетках эуокариот гидролазы могут локализоваться в ограниченных мембраной особых органоидах – лизосомах, периплазме или выделяться в среду. Большинство используемых в промышленности гидролитических ферментов представляют собой внеклеточные продукты жизнедеятельности микроорганизмов. В то же время некоторые гидролазы обнаружены в цитоплазме, где они участвуют в метаболических циклах.
Амилазы – ферменты катализирующие гидролиз крахмала, относятся ко второму подклассу гидролаз, имеют шифр 3.2.1. Эти ферменты широко распространены в природе, синтезируются многими микроорганизмами, животными и растениями. К группе амилолитических ферментов относятся α и β – амилазы, глюкоамилаза и другие.
За последние 20 лет гидролиз крахмала для получения сиропов различного состава пробрел наибольшее значение из всех промышленных процессов, использующих ферменты. Гидролизаты классифицируют согласно содержанию в них редуцирующих сахаров в пересчете на глюкозу и характеризуют декстрозным эквивалентом (ДЭ), причем чистая глюкоза составляет 100ДЭ, а крахмал. Подобрав комбинацию ферментов и условий можно получить продукты с точно определенными физическими и химическими свойствами. Ниже приведена общая схема процесса (Рис.2.8).
После измельчения исходного материала крахмал диспергируют или желатинизируют в водном растворе и ожижают с помощью термостабильной бактериальной α – амилазы при температуре от 80 до 1100С. Этот этап может быть заменен кислотным гидролизом, но, как правило с меньшей эффективностью. Ожижение занимает от 2 до 4 часов и обычно завершается когда величина ДЭ составляет 10-20. Ожижение сопровождается осахариванием, процедуру которого можно варьировать в зависимости от желаемого продукта. Добавление пуллуланазы, фермента устраняющего ветвление, и β – амилазы к декстринам приводит к получению сиропа с высоким содержанием мальтозы. Поскольку пригодные для этого микробные β – амилазы остаются дефицитными, сироп с высоким содержанием мальтозы обычно готовят с помощью смеси грибной α – амилазы и глюкоамилазы. Такой продукт содержит больше глюкозы, но соотношение глюкозы и мальтозы можно контролировать тщательным подбором пропорций этих двух ферментов и условий реакции.
Важный промышленный процесс – производство глюкозы для изомеризации ее во фруктозу. После ожижения декстрины быстро охлаждают примерно до 600С и обрабатывают глюкоамилазой в течение 24-90 часов в зависимости от использованного количества фермента. Осахаренный крахмал должен содержать не менее 94-96% глюкозы, т.к. остаточные ди- и олиглсахариды часто обладают неприятным вкусом, а изомераза не действует ни на один из них. После коррекции рН и ионной силы продукт обрабатывают изомеразой.
Проблема реализации непрерывной технологии стоит в эффективной иммобилизации второго фермента – глюкоамилазы. Во-первых, потому что α – амилаза более доступна и дешева и в принципе нет необходимости в регенерации. α – амилазой обрабатывают крахмал при кипячении в течение нескольких минут. Во-вторых, реакция иммобилизованной α – амилазы с малорастворимым, вязким крахмалом проходит с трудом. Кроме того, глюкоамилаза реагирует с растворимыми олигосахаридами, что сравнительно легко осуществить и для иммобилизованного фермента.
Сконструированы несколько типов препаратов иммобилизованного фермента обладающие хорошими свойствами, полученные – ковалентным связыванием с пористому силикагелю через глутаровый диальдегид, включением в полые волокна триацетата целлюлозы, адсорбцией на ДЕАЕ-целлюлозе и т.д. Все эти препараты характеризуются высокой стабильностью при умеренных температурах (< 500С), время полуинактивации составляет многие месяцы. Однако, с повышением температуры стабильность препаратов резко падает, и время полуинактивации снижается до 5-6 дней. Схема пилотной установки для получения глюкозного сиропа с применением иммобилизованной глюкоамилазы прведена на рис 2.9.
Исходный крахмал помещается в резервуар объемом 1 м3 (1) , где обрабатывается паром в течение 3-4 мин. Под давлением, и далее перекачивается в следующий резервуар таким же объемом (2), где подвергается обработке α – амилазой. После фильтрования разжиженный крахмал подается в реакционную колонну - биоректор (3), загруженный 16 кг иммобилизованного на микропористом кремнеземе фермента. Гидролиз декстринов проводится при температуре 400С. Время контакта 30% раствора декстринов с иммобилизованным ферментом составляет 9мин, в то время как при гидролизе растворимой глюкоамилазой оно составляет, при тех же условиях, 72 часа.
β – галактозидаза – (β – D-галактозидгалактогидролаза, лактаза, КФ 3.2.1.23) относитсяк глюкозидазам. Ферменты из разлных источников по своей структуре, размеру молекулы, молекулярной массе и активности различаются, что позволяет получать ферменты с широким диапазоном действия. В результате гидролиза ферментом молочный сахар (лактоза) превращается в более сладкую и хорошо растворимую смесь моносахаров – глюкозы и галактозы, и поэтому препараты β – галактозидазы широко применяют в молочной промышленности и в тех отраслях, где можно использовать отходы молокоперерабатывающей промышленности содержащих лактозу.
C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C6H12O6
В Италии освоено промышленное производство безлактозного молока с применением иммобилизованной лактазы (Рис.2.10).
Рис.2.10 - Технологическая схема получения безлактозного молока с использованием иммобилизованной лактазы
1. резервуар с молоком; 2- биореактор с иммобилизованным ферментом; 3-асептический резервуар
Снятое молоко из резервуара (1) пропускают через стерилизатор (температура – 1420С, время – 3 сек), быстро охлаждают до 4 – 7 0С и прокачивают через реакционную колонну (2) в асептический резервуар емкостью 500 л (3). Биореактор емкостью 20 л, содержал 4 кг иммобилизованного фермента, включенного в волокна триацетата целлюлозы. Волокна закрепляли вертикально в нижней и верхней точках реактора. Молоко через биореактор можно пропускать многократно со скоростью 7 л/мин, до достижения заданной степени конверсии. Производительность установки 10 т безлактозного молока в день.
В Англии запущен полупромышленный процесс гидролиза лактозы в молочной сыворотке с помощью иммобилизованной β – галактозидазы. Установка работает 5 дней в неделю непрерывно и обрабатывает 30 т сыворотки, производя 1,7 т сахарного сиропа (рис.2.11).
Сыворотку перед введением в биореактор подкисляют в резервуаре (1), пастеризуют, производят ультрафильтрацию и пропускают через ионообменники (4) для деминерилизации. После этого подготовленную сыворотку пропускают через реактор с иммобилизованной лактазой нисходящим потоком.. В реакторе (5) используют лактазу, ковалентно связанную с пористым силикагелем с помощью глутарового диальдегида. Биореактор периодически очищают разбавленной уксусной кислотой из резервуара (6).
Мощность установки составляет 360 л/ч, а степень гидролиза 80%.
Рис.2.11. Технологическая схема установки для гидролиза лактозы в молочной сыворотке (компания «Милк Маркетинг», Англия) 1 – резервуар для подготовки сыворотки; 2- контроль рН; 3- контроль температуры; 4- ионообменники; 5-реакционная колонка с иммобилизованным ферментом; 6- резервуар с разбавленной уксусной кислотой.
Протеолитические ферменты – пептид-гидролазы, шифр КФ 3.4, катализируют гидролиз пептидов и белков. Основной реакцией катализируемой протеолитическими ферментами, является гидролиз пептидной связи. Ферменты часто синтезируются в неактивной форме (зимогены), которые или хранятся в клетке, или транспортируются от места их синтеза к тому центру, где они необходимы в активной форме. В частности, в клетке в неактивной форме транспортируются трипсин, пепсин, химотрипсин, карбоксидазы. Активация этих ферментов осущест вляется по одному из двух путей: а) образование активных ферментов из предшественников автокаталитически; б) образование активных форм в присутствии ионов металлов. Протезы нашли широкое применение в промышленности и в медицине (Табл.1,2).
Таблица 1. Применение протеаз из организмов животных и растений
N |
фермент |
Источник |
Область применения |
1 |
трипсин |
Поджелудочная железа животных |
Медицина, мягчение мяса, осветление пива |
2 |
Пепсин |
Желудок животных |
Медицина, мягчение мяса, свертывание молока |
3 |
α –химотрипсин |
Желудок животных |
Медицина |
4 |
Ренин (химозин) |
Желудок теленка |
Производство сыра, свертывание молока |
5 |
Панкреатическая протеаза |
Поджелудочная железа животных |
Медицина, производство моющих средств, мягчение и обесволашивание кожи |
6 |
Папаин |
Папайя |
Медицина, осветление пива, мягчение мяса |
7 |
Бромелаин, |
Ананас |
Медицина, мягчение мяса, осветление пива |
8 |
Фицин |
инжир |
Медицина, мягчение мяса, осветление пива |
Таблица 2. Применение протеаз из микроорганизмов
N |
Фермент |
Источник |
Область применения |
1 |
Протеаза |
Aspergillus oryzea |
Осветление и вкусовая обработка сакэ |
2 |
Протеаза |
Aspergillus niger |
Производство кормов, медицина |
3 |
Протеаза «Субтилизин» |
Bacillus subtilis |
Производство детергентов, мягчение мяса, производство рыбных гидролизатов |
4 |
Протеаза |
Streptomyces griseus |
Производство детергентов, мягчение мяса, производство рыбных гидролизатов |
Иммобилизованные протеазы можно использовать для свертывания молока. Такой процесс необходимо проводить в два этапа – выдержки молока с ферментом и каогуляции. Только в этом случае случае достигается непрерывность процесса, т.к. при одностадийном процессе образуются творожные сгустки вокруг частиц нерастворимого фермента, что затрудняет доступ порции молока к ферменту. На стадии выдержки предусматривается обработка молока иммобилизованным ферментом при температуре ниже 150С. При этом режиме происходит гидролиз κ – казеина, но молоко не каогулирует. Каогуляция молока после обработки ферментом на холоду осуществляется нагреванием и термостатированием при температуре 370С. Процесс агрегации белков молока происходит после гидролиза 80% κ – казеина. В России получены препараты химотрипсина ковалентно связанного с КМ-целлюлозой и модифицированного химотрипсина, сорбированного на анионитах. Препараты обладают достаточно высокой активностью и испытаны на молокосвертывающую способность. Положительные результаты дали также испытания сычужного фермента иммобилизованного на поливинилспиртовых волокнах и включенных в гель альгината кальция при производстве сыра. Реологические показатели и характер пространственной структуры сгустка были аналогичны при использовании иммобилизованного и свободного сычужного фермента. Однако для внедрения в производство необходимо решить проблему стерилизации иммобилизованных препаратов ферментов после нескольких циклов работы.
Аминоацилазы - относятся к подклассу 3.5 и объединяют ферменты, действующие на C-N связи отличающиеся от пептидных. Способность аминоацилаз различать L и D – аминокислоты используют в промышленности для получения аминокислот, в том числе незаменимых. Получение оптически активных аминокислот разделением их рацемических (оптически неактивных) смесей был одним из первых процессов осуществленных с помощью иммобилизованных ферментов на промышленном уровне. Раньше этот процесс проводился с применением растворимого фермента – аминоацилазы, но он был недостаточно эффективным. После переходо на иммобилизованную аминоацилазу эффективность процесса возросла в 1,5 раза, и в настоящее время в Японии осуществляют на промышленном уровне производство большинства незаменимых аминокислот.
Чтобы найти оптимальную форму иммобилизованного фермента для этого процесса Японские ученые провели обширные исследования, результаты которых изложены в таблице 3. Эти данные говорят о том, что для промышленного использования помимо начальной активности необходимо учитывать и многие другие факторы. В данном случае исследователи остановились на аминоацилазе иммобилизованной ионными связями на ДЕАЕ-сефадексе, в силу высокой активности, простоты получения, возможности регенерации и устойчивости такого катализатора. Выбранный биокатализатор без какого-либо механического разрушения и снижения связывающей активности функционирует 5 лет.
Технологическая схема установки для получения L-аминокислот представлена на рис.2.12. В качестве исходного вещества используют ацилированные D,L-аминокислоты (ацил-DL-аминокислоты) полученные обычным химическим синтезом. Его подвергают воздействию фермента аминоацилазы, который гидролизует только один изомер, приводя к образованию незамещенной L-аминокислоты и оставляя нерасщепленной ацил-D-аминокислоту. Отщепление ацильной группы приводит к резкому увеличению растворимости L-аминокислоты и за счет этого аминокислоты легко отделить друг от друга и выделяется чистая L-аминокислот. Остающаяся ацил- D-аминокислота при нагревании рацемизируется, т.е. опять переходит в смесь ацилированных D,L-аминокислот, и процесс ферментации повторяют сначала. В итоге единственным продуктом является L-аминокислота. Причем для аминоацилазы не имеет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать, важно лишь строение ацильной части, к которой фермент имеет строгую специфичность. Т.е. в принципе одна и та же реакционная колонка с иммобилизованной аминоацилазой может быть использована в производстве самых разных L-аминокислот.
Таблица 3. Свойства иммобилизованных различными методами аминоацилаз (субстрат – ацил - D,L-метионин)
N |
свойства |
Нативная аминоацилаза |
Иммобилизованная аминоацилаза |
||
Ионное связывание с ДЕАЕ-сефадексом |
Ковалентное связывание с иодоацетилцеллюллозой |
Включение В ПААГ |
|||
1 |
Оптимальный рН |
7,5-8,0 |
7,0 |
7,5-8,5 |
7,0 |
2 |
Оптимальная температура, 0С |
60 |
72 |
55 |
65 |
3 |
Энергия реактивации, ккал/моль |
6,9 |
7,0 |
3,9 |
5,3 |
4 |
Оптимальная концентрация Со2+ ,мМ |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
5 |
Км, мМ |
5,7 |
8,7 |
6,7 |
5,0 |
6 |
Vmax, мкМ/ч |
1,5 |
3,3 |
4,6 |
2,3 |
7 |
Методика получения |
|
Простая |
Сложная |
Сложная |
8 |
Связывающие силы |
|
Слабые |
Сильные |
Сильные |
9 |
Возможность регенерации |
|
Возможна |
Невозможна |
Невозможна |
Препарат иммобилизованной аминоацилазы готовили следующим образом. 1000 л ДЕАЕ-сефадекса перемешивали с 1100-1700 л водного раствора аминоацилазы при 350С и рН 7,0 в течение 10 часов. После фильтрации иммобилизованный препарат промывали водой. Выход активности по отношению к первоначально растворенному ферменту составлял 55-60%. Колонна с иммобилизованной аминоацилазой сохраняла более 60% первоначальной активности после месяца работы. Регенерация катализатора в колонне производится путем простого добавления свежего раствора фермента, который опять адсорбируется на носителе. Устойчивость полимерного носителя составляет 5-8 лет.
Рис.2.12. Технологическая схема производства L-аминокислот из рацемической смеси с применением иммобилизованной аминоацилазы 1- резервуар с исходной рацемической смесью; 2-фильтр; 3- теплообменник; 4- биореактор с иммобилизованным ферментом; 5- испаритель; 6- кристаллизатор; 7- сепаратор; 8- рацемизатор.
Пенициллинацидаза – ( пенициллинамидаза, ацил-трансфераза) относится к третьему классу, катализирует гидролиз боковых цепей пенициллинов и их производных воздействуя на C-N связь. Ферменты выделенные из разных источников имеют различные характеристики субстратов и это используется для классификации различных типов пенициллинамидаз. Различают три типа пенициллинамидаз. Если фермент гидролизует специфический пенициллин V то обозначается тип I. Эти ферменты имеются в грибах и бактериях. Ферменты типа II специфичны к пенициллину G и содержатся только в бактериях. К III типу относят все пенициллинамидазы катализирующие гидролиз аминоациллины и цефалоспорины.
При ферментативном гидролизе пенициллинов и цефалоспоринов образуются, соответственно 6-амнопенициллановая (6-АПК) и 7-аминоцефалоспориновая кислоты, которые затем используют для получения полусинтетических антибиотиков. Различными компаниями получены и производятся разные препараты иммобилизованной пенициллинамидазы. По Итальянской технологии иммобилизованный препарат готовят смешиванием раствора фермента с триацетатом целлюлозы в хлористом метилене. Образующуюся эмульсию с ферментом далее подвергают экструзии в нити. Волокна триацетата целлюлозы, содержащие иммобилизованный фермент, размещают вдоль термостатируемой колонны. Общий выход составляет 85%.
В Росси на ОАО «Биохимик» для производства :-АПК используют пенициллинамидазу включенную в полиакриламидный гель модифицированный глутаровым диальдегидом.